一种编码β-甘露聚糖酶的基因，以及含该基因的重组质粒和重组菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及β‑甘露聚糖酶技术领域，具体地，涉及一种编码β‑甘露聚糖酶的基因及以及含该基因的重组质粒和重组菌及其构建方法。所述编码β‑甘露聚糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ UENCE NO.2所示。

A gene encoding \u03b2 - mannanase, a recombinant plasmid containing the gene, a recombinant bacterium and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种编码β-甘露聚糖酶的基因，以及含该基因的重组质粒和重组菌及其构建方法
本专利技术涉及β-甘露聚糖酶
，具体地，涉及一种编码β-甘露聚糖酶的基因及以及含该基因的重组质粒和重组菌及其构建方法。
技术介绍
甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。β-甘露聚糖是非淀粉多糖(NSP)的一种，是籽实类植物细胞壁的主要组成成分，尤其在棕榈粕、椰子粕、豆粕、芝麻粕中含量最多，在其他植物性饲料原料中含量也很高，如玉米、小麦、菜籽粕、麸皮等。甘露聚糖是以1,4-β-D-吡喃甘露糖苷键连结而成的线状多糖，如果主链某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过1,6-α-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖(galactomannan)、葡甘露聚糖(glucomannan)、半乳葡甘露聚糖(galactoglucomannan)(龙健儿等，1998)。豆粕中甘露聚糖属于半乳甘露聚糖(galactomannan)。上述物质构成了植物半纤维素的第二大组份，这些物质的降解主要依靠的酶就是β-甘露聚糖酶(β-mannanase；endo-1,4-β-D-mannanmannohydrolaser，EC3.2.1.78)。β-甘露聚糖酶是一种新型的工业酶制剂，可广泛应用于食品、医药、造纸、饲料、石油开采及精细化工等行业，对于自然资源的高附加值开发、发展生物技术改造化学工业，满足资源、环境、能源、医药等领域内的需求具有重要意义。β-甘露聚糖酶为一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长。其主要原理是：1、消除饲料中甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高豆粕的能量消化率，能给玉米豆粕型日粮提高100-150kcal/kg的代谢能。2、甘露聚糖分解产生的甘露寡糖，可被动物肠道中的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌、沙门氏菌的感染。减少肉鸡球虫病的危害，提高肉鸡均匀度。3、降低肠道粘度，促进能量、蛋白、纤维素的消化和吸收。因此，研究β-甘露聚糖酶，优化β-甘露聚糖酶基因的表达和提高β-甘露聚糖酶生产甘露糖的效率具有极大的市场价值。
技术实现思路
为此，本专利技术提供了一种编码β-甘露聚糖酶的基因，以及含该基因的重组质粒和重组菌，该重组质粒的构建方法，β-甘露聚糖酶的体外表达方法，以及利用该β-甘露聚糖酶水解生产甘露单糖的应用。本专利技术的技术方案如下：一种编码β-甘露聚糖酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQUENCENO.2所示。一种重组质粒，包含如SEQIDNO.2所示的基因，所述重组载体为重组pPICZaA质粒，所述基因插入所述pPICZaA质粒的多克隆位点。一种重组菌，包含上述的重组质粒。所述的重组菌为重组毕赤酵母GS115菌株。上述的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：1)密码子偏向性优化：对β-甘露聚糖酶的核苷酸序列SEQIDNO:1根据酵母菌的密码子偏好性进行改造，获得适宜在酵母菌内高效表达的核苷酸序列SEQIDNO:2；2)pPICZaA表达载体构建：以质粒pPICZaA为载体，将核苷酸序列SEQIDNO:2插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoRI，3'端酶切位点为NotI，构建pPICZaA-LrMan5B表达载体。一种β-甘露聚糖酶的体外表达方法，所述β-甘露聚糖酶的核苷酸序列如SEQUENCENO.2所示，包括如下步骤：1)密码子偏向性优化：对β-甘露聚糖酶的核苷酸序列SEQIDNO:1根据酵母菌的密码子偏好性进行改造，获得适宜在酵母菌内高效表达的核苷酸序列SEQIDNO:2；2)pPICZaA表达载体构建：以质粒pPICZaA为载体，将核苷酸序列SEQIDNO:2插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoRI，3'端酶切位点为NotI，构建pPICZaA-LrMan5B表达载体；3)重组蛋白表达：将所述的pPICZaA-LrMan5B表达载体线性化，电转导入处于化学感受态的表达菌株PichiapastorisX33，形成重组表达菌株pPICZaA-LrMan5B-PichiapastorisX33，挑选高效表达的阳性克隆进行培养，并利用甲醇诱导重组表达菌分泌表达β-甘露聚糖酶。用上述的β-甘露聚糖酶水解生产甘露糖的方法，β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶协同生产甘露糖。β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶协同生产甘露糖的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了所述编码β-甘露聚糖酶的基因，以及含该基因的重组质粒和重组菌，该重组质粒的构建方法，β-甘露聚糖酶的体外表达方法，以及利用该β-甘露聚糖酶水解生产甘露单糖的应用。在50℃条件下，所述β-甘露聚糖酶的在pH4.5-6.0之间都具有较高的活性，在pH为5.0时，即达到最高酶活；在pH为5.0条件下，β-甘露聚糖酶酶活力在温度为65℃时达到最大值，到75℃时酶活力含具有70以上的相对酶活力。β-甘露聚糖酶在pH为3.0-8.0条件下都具有较好的稳定性，也具有较好的温度耐受性。在最适条件下，β-甘露聚糖酶的Km和Vmax分别为1.276mg/mL和2266umol/min·mg。本专利技术中LrMan5B基因编码的β-甘露聚糖酶与β-甘露糖苷酶协同分解β-甘露糖苷产生甘露糖，甘露糖的生成量大大提高，这表明LrMan5B基因编码的β-甘露聚糖酶在工业上生产甘露糖具有重要的意义。附图说明：图1为本专利技术所述质粒pPICZaA-LrMan5B的酶切的产物在琼脂糖凝胶上电泳检测结果图。泳道M为DNA分子量Marker,其条带分子量自上向下依次为10000bp,5000bp,3000bp，2000bp,1500bp，1000bp,700bp,500bp和250bp。泳道1为所述质粒pPICZaA-LrMan5B的酶切的产物，其中，5000bp至3000bp之间的条带为质粒pPICZaA的DNA片段，1500bp至1000bp之间的条带为LrMan5B的DNA片段。图2为质粒pPICZaA-LrMan5B图谱。图3为质粒pPICZaA-LrMan5B导入毕赤酵母后，毕赤酵母表达产物的SDS-PAGE检测结果图。图3中Marker为蛋白质分子量，最左侧数字标示了Marker泳道的蛋白质条带的分子量；泳道1为含有LrMan5B基因编码的β-甘露聚糖酶的毕赤酵母表达菌株发酵液，泳道2为纯化后的LrMan5B基因编码的β-甘露聚糖酶。图4为在50℃下，缓冲液的pH值对β-甘露聚糖酶的酶活力的影响的检测结果图。横坐标代表pH值，纵坐标代表酶活力。图5为温度对β-甘露聚糖酶酶活力的影响的检测结果图，横坐标代表温度值，纵坐标代表酶活力。图6为pH值对β-甘露聚糖酶的稳定性的影响的检测结果图，横坐标代表pH值，纵坐标代表酶活力。图7为β-甘露聚糖酶温度耐受性的测定的结果图，横坐标代表温度值，纵坐标代表酶活力。图8为以洋槐豆胶为底物，在不同底物浓度下测定β-甘露聚糖酶比活力的检测结果图。横坐标代表底物浓度值，纵坐标代表酶活力。具体实施方式为了使本专利技术的专利技术目的，技术方案及技术效果更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码β‑甘露聚糖酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQUENCE NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种编码β-甘露聚糖酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQUENCENO.2所示。2.一种重组质粒，其特征在于，包含如SEQIDNO.2所示的基因，所述重组载体为重组pPICZaA质粒，所述基因插入所述pPICZaA质粒的多克隆位点。3.一种重组菌，其特征在于，包含如权利要求2所述的重组质粒。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组毕赤酵母GS115菌株。5.一种如权利要求2所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)密码子偏向性优化：对β-甘露聚糖酶的核苷酸序列SEQIDNO:1根据酵母菌的密码子偏好性进行改造，获得适宜在酵母菌内高效表达的核苷酸序列SEQIDNO:2；2)pPICZaA表达载体构建：以质粒pPICZaA为载体，将核苷酸序列SEQIDNO:2插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoRI，3'端酶切位点为NotI，构建pPICZaA-LrMan5B表达载体。6.一种β-甘露聚糖酶的体外表达方法，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢建华，徐莉敏，何志梅，王铮，陈伟海，
申请(专利权)人：东莞泛亚太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44