一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和应用，该基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明专利技术利用体外构建无抗生素筛选标记的多拷贝的方法，实现了酸性哺乳动物几丁质酶的高量表达，同时利用辅助因子Hac1的共表达，实现了酸性哺乳动物几丁质酶表达量的进一步提高。

An acidic mammalian chitinase coding gene and its application

【技术实现步骤摘要】
一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和应用
本专利技术属于分子生物
，具体而言，涉及一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因、重组载体、转化体和应用。
技术介绍
几丁质(甲壳素)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚物,是最丰富的天然高分子化合物之一。几丁质经几丁质酶水解后的产物几丁二糖，在医药保健等领域具有很高的应用价值。根据几丁质酶作用时的切割位点不同,可将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶两大类。内切几丁质酶在几丁质链内部随机切割，产生分子量更小的几丁寡糖；外切几丁质酶催化底物水解时从几丁质链的还原末端或非还原末端释放(GlcNAc)2，以及可以分解内切几丁质酶产生的低聚物为单体的β-N-乙酰氨葡萄糖苷酶。由于天然甲壳素在一般溶剂中或中性条件下不可溶解，大大降低了其水解效率，因此需要经过繁琐的步骤制备成胶体几丁质才能被酶水解。另外，在酸性条件下几丁质的溶解性显著增加，从而可提高几丁质酶的水解效率，因此酸性几丁质酶(AMCase)在几丁质的水解上表现出明显的优势。然而，目前虽然有研究报道酸性几丁质酶在大肠杆菌宿主中进行异源表达，但是存在表达量比较低，以及活性低的问题，使其在工业应用方面存在明显的弊端。通过检索国内外现有技术，尚未发现酸性哺乳动物几丁质酶在宿主中大量表达的方法应用。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于通过优化现有的哺乳动物几丁质酶基因序列，从而提供一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和重组载体、转化体以及遗传工程化的宿主细胞。为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种酸性哺乳动物几丁质酶的编码基因，该基因经过碱基优化后具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。另外，该基因编码具有seqNO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。一种重组载体，该重组载体包含上述几丁质酶的编码基因，所述编码基因的拷贝数为4。进一步优选出多组重组载体，所述重组载体是在pHBM905M载体的CpoI和NotI位点插入所述酸性哺乳动物几丁质酶的编码基因而得，进而通过串联表达框，得到含有4拷贝的重组载体。本专利技术还提供两种转化体，转化体可以为重组菌，其包含上述重组载体。例如，将酸性哺乳动物几丁质酶基因插入载体pHBM905M的CpoI和NotI位点得到的重组表达载体，及含有基因多拷贝表达框的重组表达载体转化至毕赤酵母GS115得到重组菌。另外一种转化体为以酸性哺乳动物几丁质酶4拷贝GS115重组菌，再次转入辅助因子(Hac1、Pdi1和Mrx1)进行共表达的新型重组菌。本专利技术还提供多对引物，用于扩增上述的酸性哺乳动物几丁质酶编码基因全长及共表达所需的各种辅助因子。一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述的重组载体。进一步优选地，所述遗传工程化的宿主细胞除含有几丁质酶4拷贝的重组载体外，还包含插入辅助因子Hac1基因序列的重组载体。所述重组载体为载体pGAPZB的EcoRI和AgeI位点插入目标基因得到的重组表达载体。哺乳动物几丁质酶首次在小鼠体内发现，属于真核细胞来源的基因。而本专利技术人选用的毕赤酵母GS115存在真核基因具有的翻译后修饰特点，且能够进行分泌表达和高密度发酵，满足工业化应用的条件。因此，我们选择毕赤酵母GS115作为出发菌株进行酸性哺乳动物几丁质酶的表达。最后，本专利技术还提供了上述编码基因编码的酸性哺乳动物几丁质酶在水解甲壳素或/和胶体几丁质中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下几点的进步性：(1)利用体外构建无抗生素筛选标记的多拷贝的方法，实现了酸性哺乳动物几丁质酶的高量表达，但拷贝数与表达量并不是成正比；(2)不同辅助因子的共表达，实现了酸性哺乳动物几丁质酶表达量的进一步提高，其中Hac1促进作用最强；(3)本专利技术的酸性哺乳动物几丁质酶表达量和活性均为目前报道最高。附图说明图1为酸性哺乳动物几丁质酶多拷贝质粒构建验证DNA电泳图，其中泳道1/2/3/4//6分别为酸性哺乳动物几丁质酶1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、6拷贝质粒。图2为酸性哺乳动物几丁质酶多拷贝构建质粒酶切验证DNA电泳图，其中泳道1/2/3分别为1拷贝、2拷贝、3拷贝SalI线性化结果，泳道4/5/6分别为3拷贝、4拷贝、6拷贝用XbaI和BamHI双酶切。图3为酸性哺乳动物几丁质酶1,2,3,4,6拷贝菌株表达的SDS-PAGE检测图。图4为辅助因子和酸性哺乳动物几丁质酶共表达SDS-PAGE检测图。图5为Hac1共表达的酸性哺乳动物几丁质酶直接水解甲壳素(a)和胶体几丁质(b)0-6h的HPLC检测图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、酸性哺乳动物几丁质酶基因序列密码子优化将来源于小鼠胃组织的哺乳动物几丁质酶的基因序列进行一定程度的密码子优化：a、减少连续的A/T/G/C碱基出现几率，避免产生茎环结构；b、在整个基因序列中，增加一些稀有密码子，特别是翻译起始阶段，来降低核糖体的延伸速率。优化后的酸性哺乳动物几丁质酶基因序列如SEQIDNO.2所示，整个序列和原始序列相比优化率达23.4％。实施例2、表达载体的构建及蛋白质表达1、基因序列的人工合成SEQIDNO.2所示的核苷酸序列委托武汉金开瑞生物工程有限公司按照本领域的常规技术进行基因人工合成，基因插入质粒载体pUC57中，保存，备用。2、基因序列的扩增根据SEQIDNO.2所示的核苷酸序列设计引物对(Dchit-F，Dchit-R)正向引物的下划线部分为CpoI的酶切位点，反向引物的下划线部分为NotI酶切位点，此位点的序列设计符合T4DNA聚合酶作削的方法所产生的粘性末端。PCR反应体系：PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸10s，30轮循环扩增，最后72℃终延伸10min。用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA纯化试剂盒(GeneMark公司生产)纯化。3、重组表达载体的构建1)将上述纯化的PCR产物用T4DNA聚合酶作削的方法处理，然后进行溶液回收产物。将质粒pHBM905M用CpoI和NotI双酶切，1％琼脂糖电泳回收酶切产物。2)将步骤1)中的PCR溶液回收产物和载体的双酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Gold后涂布于含有100μg/mL氨苄抗生素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用引物Dchit-F和Dchit-R进行菌落PCR，筛选到含有酸性哺乳动物几丁质酶基因的重组菌，抽提重组菌的质粒并进行双酶切验证，进一步通过测序验证。结果表明，在pHBM905M的CpoI和NotI酶切位点之间插入了酸性哺乳动物几丁质酶基因的DNA片段,将该重组质粒命名为pAMC1c(pHBM905M-Dchit-1copy)。4、酸性哺乳动物几丁质酶多拷贝质粒的构建重组载体pHBM905M-Dchit表达框的5’端含有XbaI酶切位点，3’端含有SpeI和BamHI酶切位点。因XbaI和SpeI为同尾酶，故利用XbaI/BamHI两种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酸性哺乳动物几丁质酶的编码基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种酸性哺乳动物几丁质酶的编码基因，其特征在于，所述基因具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述几丁质酶的编码基因，所述编码基因的拷贝数为4。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是在pHBM905M载体的CpoI和NotI位点插入所述几丁质酶的编码基因而得，进而通过串联表达框，得到含有4拷贝的重组载体。4.一种转化体，其特征在于，包含权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂敏，杜超，周玉玲，何华华，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42