不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法技术

本发明专利技术适用于生物技术应用研究领域，提供了一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法，包括以下步骤：纯化获得各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白；检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白对特异性重组型底物的水解活性，并获取特异性重组型底物水解活性数据；分别检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白、以及组合重组蛋白对特异性内源性天然底物的水解活性，获取特异性内源性天然底物水解活性数据；将所述特异性重组型底物水解活性数据和特异性内源性天然底物水解活性数据进行整理、比较分析，筛选所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白的活性组合。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术应用研究领域，尤其涉及一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法。
技术介绍
梭状神经毒素(ClostridialNeurotoxins，CNTs)是导致人类中毒的最强蛋白质类毒素之一，其中肉毒神经毒素(BotulinumNeurotoxins，BoNTs)导致肌肉松弛性麻痹，破伤风神经毒素(TetanusNeurotoxin，TeNT)导致痉挛性麻痹。CNTs全长为150kDa,整体而言，可划分为N端的活性区域，即轻链(lightchain,LC)，约为50kDa，C端的受体识别和结合区域，即重链(heavychain,HC)，约为100kDa，而重链还可进一步划分为轻链输送区域(HCT)和受体结合区域(HCR)两个亚区域。对BoNTs而言，目前已有七种不同血清型(依次命名为BoNT-A至BoNT-G型)获得分离鉴定，它们能够专一性地靶向神经细胞，并特异性地水解位于神经突触细胞膜上或囊泡膜上的底物，从而抑制神经递质(比如乙酰胆碱)的释放，导致疾病。七种亚型肉毒神经毒素血清型中，BoNT-A、BoNT-B、BoNT-E和BoNT-F型能引起人肉毒中毒症状，其中BoNT-A型的毒性最强，致死剂量可以低至微克级。美国CDC(CenterforDiseaseControlandPrevention)把BoNTs定义为A类试剂和潜在的生物恐怖武器。而基于BoNTs中毒还具有可逆性、局部性和持久性等特点，BoNTs及其衍生物也被视为可用来治疗神经肌肉类症状的新型药物。尽管BoNTs应用广泛，但基于BoNTs的治疗药物的有效期往往比较有限，需要重复多次注射，所以不可避免地有病人产生免疫抵抗，从而降低甚至完全抵消治疗效果。目前，普遍认为导致病人产生中和抗体的因素主要有两个，即治疗药物中的神经毒素(有效成分)和非神经毒素成分(比如与神经毒素相结合的血凝素等其他蛋白质)，此外，免疫抵抗现象的出现还涉及到病人体质，药物成分和用药时间等多种因素。近年来已经有很多研究涉及到如何解释或解决免疫抵抗问题，并且已经有若干相关专利获得批准，然而其应用空间仍然受到限制。综合目前相关的研究成果，提高BoNTs类治疗药物的生物活性，从而降低BoNTs类治疗药物的使用剂量，似乎可以成为未来的一个行之有效的解决免疫抵抗问题的可行方案。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可能降低甚至消除免疫抵抗水平的不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法，旨在解决现有BoNTs类治疗药物容易产生免疫抵抗现象的问题。本专利技术是这样实现的，一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法，包括下述步骤：纯化获得各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白；检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白对特异性重组型底物的水解活性，并获取特异性重组型底物水解活性数据；将所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白以不同形式组合、或将所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶与LC/TeNT的重组蛋白以不同形式组合，得到组合重组蛋白，分别检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白、以及所述组合重组蛋白对特异性内源性天然底物的水解活性，获取特异性内源性天然底物水解活性数据；将所述特异性重组型底物水解活性数据和特异性内源性天然底物水解活性数据进行整理、比较分析，筛选所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白的活性组合。本专利技术提供的不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法，通过将组合前后的所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶进行特异性内源性天然底物的水解活性筛选，从而获得水解效率得到提高的肉毒神经毒素轻链蛋白酶的活性组合筛选方案，为BoNTs类治疗药物容易产生免疫抵抗问题提供一个可能的解决途径。附图说明图1是本专利技术实施例3和4提供的单种或肉毒神经毒素轻链蛋白酶的组合各自轻链蛋白酶对内源性天然底物的水解活性结果图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法，包括下述步骤：S01.纯化获得各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白；S02.检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白对特异性重组型底物的水解活性，并获取特异性重组型底物水解活性数据；S03.将所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白以不同形式组合、或将所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶与LC/TeNT的重组蛋白以不同形式组合，得到组合重组蛋白，分别检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白、以及所述组合重组蛋白对特异性内源性天然底物的水解活性，获取特异性内源性天然底物水解活性数据；S04.将所述特异性重组型底物水解活性数据和特异性内源性天然底物水解活性数据进行整理、比较分析，筛选所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白的活性组合。具体的，上述步骤S01中，肉毒神经毒素中的轻链,即N端的活性区域。为了获得高活性的肉毒神经毒素，需要提供所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶，并纯化出所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白。采用所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶，可提高所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及其组合后对内源性天然底物的水解活性，而在作为治疗药物使用时提高有效浓度，同等条件下可以降低单个肉毒神经毒素的使用剂量，从而解决免疫抵抗问题。常规分离纯化肉毒神经毒素的过程中，为了防止毒素泄露或扩散而影响周边环境，需要严格控制操作空间。为了避免上述现象的发生，作为本专利技术优选实施例，所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶重组蛋白的纯化，以原核表达系统表达纯化实现。以原核表达系统表达纯化获得的各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶重组蛋白，不仅可以防止泄露造成的毒素污染，还能以便捷的方式获得高纯度的所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶重组蛋白。研究证明，自然与神经毒素一起构成肉毒神经毒素复合物的蛋白质能对肉毒神经毒素起到保护作用，该保护作用可持续到肉毒神经毒素侵入到人体或动物体内后的一段很长的迁移过程。一旦失去了自然与神经毒素一起构成肉毒神经毒素复合物的复合蛋白质的保护作用，在到达作用位点时肉毒神经毒素的质和量都会有所损失。本专利技术实施例中，作为优选实施例，为了提高亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶活性组合的筛选范围，所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶既可以是纯的重组型毒素蛋白，也可以是任何其他包含有功能性肉毒神经毒素轻链蛋白酶的复合物或混合物。本专利技术实施例中，所述肉毒神经毒素轻链蛋白酶可包括所述肉毒神经毒素轻链蛋白酶的各种亚型。作为优选实施例，所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶、以及参与组合成所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白中至少包括但不限于LC/BoNT-A、LC/BoNT-B、LC/BoNT-D、LC/BoNT-E、LC/BoNT-F。其中，BoNT为肉毒神经毒素，A、B、D、E、F分别肉毒神经毒素的几种亚型，TeNT为破伤风神经毒素，LC表示轻链。所述LC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法，包括下述步骤：纯化获得各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白；检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白对特异性重组型底物的水解活性，并获取特异性重组型底物水解活性数据；将所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白以不同形式组合、或将所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶与LC/TeNT的重组蛋白以不同形式组合，得到组合重组蛋白，分别检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白、以及所述组合重组蛋白对特异性内源性天然底物的水解活性，获取特异性内源性天然底物水解活性数据；将所述特异性重组型底物水解活性数据和特异性内源性天然底物水解活性数据进行整理、比较分析，筛选所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白的活性组合。

【技术特征摘要】
1.一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的活性组合筛选方法，包括下述步骤：纯化获得各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白；检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白对特异性重组型底物的水解活性，并获取特异性重组型底物水解活性数据；将所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白以不同形式组合、或将所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶与LC/TeNT的重组蛋白以不同形式组合，得到组合重组蛋白，分别检测所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶及LC/TeNT的重组蛋白、以及所述组合重组蛋白对特异性内源性天然底物的水解活性，获取特异性内源性天然底物水解活性数据；将所述特异性重组型底物水解活性数据和特异性内源性天然底物水解活性数据进行整理、比较分析，筛选所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶的重组蛋白的活性组合。2.如权利要求1所述的一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的组合筛选方法，其特征在于，所述各亚型肉毒神经毒素轻链蛋白酶至少包括LC/BoNT-A、LC/BoNT-B、LC/BoNT-D、LC/BoNT-E、LC/BoNT-F。3.如权利要求1所述的一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的组合筛选方法，其特征在于，所述特异性内源性天然底物为来自神经元组织、神经元细胞。4.如权利要求3所述的一种不同亚型肉毒神经毒素蛋白的组合筛选方法，其特征在于，所述特异性内源性天然底物为Ne...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈声，郭九标，
申请(专利权)人：香港理工大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44