具有三螺旋结构的蛋白质物质及其制造方法技术

作为致力研究的结果，本发明专利技术人成功地发明专利技术了一种易纯化、在具有低分子量的同时保持有与天然存在的胶原相同的三螺旋结构的胶原基因构建体。具体地，由于CR‑D(信号肽)具有糖识别结构域，所以能通过亲和纯化进行一步纯化。通过用MBL的类胶原结构基因部分取代本发明专利技术的人胶原结构基因部分，能获得高纯度和大量的保持三螺旋结构并且热稳定的低分子量胶原。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是2009年12月22日申请的专利技术名称为“具有三螺旋结构的蛋白质物质及其制造方法”的第200980157245.2号专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及具有三螺旋结构的蛋白和生产这些蛋白的方法。更具体地，本专利技术涉及人类胶原类似物和它们的生产方法。本专利技术的一个目的是提供由对生物机体安全的并且可以轻易地纯化并获得的人类重组蛋白组成的胶原类似物，以及它们的生产方法。更具体地，本专利技术提供了用于生产由重组蛋白组成的胶原类似物的方法，该重组蛋白中引入的基因全部是人类的基因，其中通过稳定地将插入了包含人类胶原的重组蛋白的cDNA的哺乳动物表达载体转导到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中来实施该方法。
技术介绍
近年来，再生医学中最重要的材料之一的实例是胶原。胶原是一种典型的蛋白，其分布于生物机体的几乎所有组织中(皮肤，骨骼，软骨，等等)，并且公知在生物机体中具有重要功能，如通过成为细胞的支架来维持生物学组织和器官的结构。而且，它具有调节细胞增殖、分化和迁移的各种生理学功能。由于这些事实，它正通过与细胞、生长因子等等一起用于组织工程医学中而受到再生医学领域的关注。迄今为止，胶原已经广泛用于医学领域，用作人造器官移植物(专利文献1)、持续性药物释放基质(专利文献2)、人造皮肤(专利文献3)和用于伤口的绷带基质以及用于伤口治疗的基质的生物相容材料的组分(专利文献4)。生物机体的全部胶原的40％存在于皮肤中，皮肤/腱干重的70％或更多为胶原。因此，胶原在人造皮肤的开发中是很重要的。特别地，胶原用作生物材料用于修复生物体中的损伤。例如，已经报道了它用作涂覆材料用于皮肤损害如灼伤的位点的治愈和改善作用(非专利文献1和2)。这意味着其具有很大的希望应用于目前显著发展的再生医学领域。而且，它用作可用于细胞和器官的培养技术的材料(专利文献5和6)。另外，已经指出口服胶原(Ⅱ型胶原)等等可用于抑制类风湿性关节炎(非专利文献3)。而且，通过设计表达人类胶原(VII型胶原)的部分肽的基因，并引入低分子量胶原基因到表皮水疱症细胞中进行治疗的可能性也已经被报道过(非专利文献4)。目前使用的很多胶原都来自非人哺乳动物物种如牛或猪。据报道当这些胶原被移植到人类中时，大约3％的患者出现过敏反应(非专利文献5和6)。而且，近年来，来自非人哺乳动物物种的胶原具有朊病毒或病原体的污染风险已经成为一个主要问题。因此，强烈需要一种用于生产低抗原性而且没有病原体污染的安全的人类胶原的系统。为了避免这种问题，一些专利技术人已经专利技术了一种通过用插入了编码人胶原的cDNA的重组病毒感染昆虫细胞以生产具有与人体中相同的三螺旋结构的重组人胶原方法，而且已经申请了专利(专利文献7)。而且，也已专利技术了使用哺乳动物细胞或酵母细胞生产人胶原的方法(专利文献8)。[现有技术文献][专利文献][专利文献1]日本特开2007-204881号公报[专利文献2]日本特开2001-316282号公报[专利文献3]日本特开2005-314号公报[专利文献4]日本特开2007-160092号公报[专利文献5]日本特开2002-142753号公报[专利文献6]日本特再表2005-014774号公报[专利文献7]日本特开8-23979号公报[专利文献8]日本特表平7-501939号公报[非专利文献][非专利文献1]Surg.Forum,10,303(1960)[非专利文献2]J.Surg.Res.,10,485-491(1960)[非专利文献3]Science,261,1727-1730(1993)[非专利文献4]THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 275卷,第32期,8月第11期,24429-24435页,2000[非专利文献5]J.Immunol.136:877-882,1986[非专利文献6]Biomaterials 11:176-180,1990
技术实现思路
可见，胶原是一种可用作药物产品或用于活体供体移植或再生医学的生物材料的物质；但是，通常使用的胶原来自于非人哺乳动物物种如猪和牛的组织。胶原本来就是一种具有低免疫原性的蛋白，而且正被作为生物材料移植、包埋或注射到人体中。但是，尽管频率较低仍有报道说来自于非人哺乳动物物种的组织的胶原引起免疫反应，(J.Immunol.,136,877-882(1986)；Biomaterials,11,176-180(1990))。而且，由于牛的朊病毒污染的可能性，不可能使用源自牛的胶原。此外，目前用于胶原纯化和提取的哺乳动物，例如猪中，无法保证不含有未知的污染物(病原性病毒等等)如朊病毒污染，来自于非人哺乳动物的胶原应用于人类的同时，也引起了安全问题。另外，生物学来源的胶原的一个问题是，由于包含大量杂蛋白，纯化期间多步纯化变得必要，这样纯化方法变得复杂。考虑到以上问题，人类来源的胶原作为直接应用于人类的生物材料是合乎需要的。可以从人类来源(如人的胎盘)纯化人类来源的胶原(美国专利5,002,071和5,428,022)。但是，使用人类来源的胶原时也存在几个问题：(1)由于该材料是人组织，该材料的供应有限；(2)不能完全消除具有病原性病毒如肝炎病毒和人类免疫缺陷性病毒(HIV)污染的可能性；(3)从胎盘收集的胶原种类是不均匀的而且品质不完全相同；和(4)从人类提取和纯化胶原存在伦理问题。由于获得的胶原中形成非特异性的桥接，导致纯化变得困难，因此还存在质量问题。迄今，已经研究了使用基因工程技术生产胶原的方法，以消除病原体污染的风险并获得分离和纯化步骤简单的大量胶原(Biochem.Soc.,28,350-353(2000))。但是，胶原分子的分子量为100000或更多，而且非常大，用于引入到宿主细胞中的表达载体的制备非常复杂。另外，常规方法无法获得维持实际应用的生产水平低。此外，胶原是一种采用3条多肽链缔合的三螺旋结构的分子，而且这种结构是通过大量翻译后修饰而形成的(N.Engl.J.Med.,311,376-386(1984))，但是预计只有特定的细胞具有这种修饰能力。众所周知为了使胶原形成三螺旋结构，胶原结构域中的脯氨酸必须是羟基化的。为了生产具有三螺旋结构的胶原，提供了一种通过在昆虫细胞中共表达人类胶原和脯氨酸羟化酶生产重组胶原的方法(日本特开2002-315580号公报)。但是，为了共表达脯氨酸羟化酶，必须共表达至少3个基因，即胶原与脯氨酸羟化酶的α亚单位和β亚单位，而且细胞的克隆变得非常复杂。在此之前已经试验使用仓鼠胚胎细胞、小鼠成纤维细胞等等作为宿主生产人类来源的重组胶原(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,84,764-768(1987)；J.Biol.Chem.,264,20683-20687(1989))。这些例子中获得的胶原的分子结构是正常的，但是混合了宿主细胞来源的胶原和外源基因来源的胶原。而且，在人纤维肉瘤细胞HT1080中表达Ⅱ型胶原的例子中(Biochem.J.,298,31-37(1994))，生产水平较低(每1L培养物0.5～1mg)，而且不能持续用于实际应用。而且，观察到与外源基因来源的Ⅱ型胶原相等含量的人纤维肉瘤细胞HT1080来源的Ⅳ型胶原。因此，必须从内源的Ⅳ本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有三螺旋结构的重组蛋白作为胶原类似物的用途，其中该蛋白包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸从氨基末端依次包含下列(i)～(v)：(i)人胶原凝集素的信号肽结构域基因；(ii)人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因；(iii)人胶原的胶原结构域基因；(iv)人胶原凝集素的颈结构域基因；和(v)人胶原凝集素的糖识别结构域基因。

【技术特征摘要】
2008.12.22 JP 2008-3256911.具有三螺旋结构的重组蛋白作为胶原类似物的用途，其中该蛋白包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸从氨基末端依次包含下列(i)～(v)：(i)人胶原凝集素的信号肽结构域基因；(ii)人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因；(iii)人胶原的胶原结构域基因；(iv)人胶原凝集素的颈结构域基因；和(v)人胶原凝集素的糖识别结构域基因。2.权利要求1的用途，其中人胶原凝集素的信号肽结构域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的信号肽结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:4的多核苷酸。3.权利要求1的用途，其中人胶原凝集素的富含半胱氨酸的结构域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的结构域基因，而且是包含核苷酸序列SEQ ID NO:5的多核苷酸。4.权利要求1的用途，其中人胶原凝集素的颈结构域...

【专利技术属性】
技术研发人员：铃木祐介，田原宽，山本启一，北原让，铃木定彦，
申请(专利权)人：国立大学法人北海道大学，扶桑药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP