基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法制造技术

本发明专利技术公开了一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法；通过设计生物素标记的tlh基因的引物，以环介导等温扩增技术快速扩增tlh基因，扩增过程产生的大量的具有生物素标记重复序列，将链霉亲和素修饰的纳米金快速聚集，并产生强烈的颜色变化效应，达到对特定基因检测的目的。本发明专利技术建立了水产品中副溶血性弧菌经济、快速、准确、特异、灵敏、简便的检测诊断方法，提高医学卫生检验、疾病防控、水产品加工和进出口检验等部门的检测质量和效率。

Detection of Vibrio parahaemolyticus based on isothermal amplification of gold nanoparticles in response to discoloration

The invention discloses a nano gold color in response to Vibrio parahaemolyticus detection method based on isothermal nucleic acid amplification; TLH gene primers designed by biotinylated, by loop mediated isothermal amplification rapid amplification of TLH gene amplification technology, the process produces a large amount of labeled with biotin streptavidin will repeat, nano gold in the modified fast aggregation, and has the color change effect strong, to achieve the purpose of detecting specific genes. The present invention establishes Vibrio parahaemolyticus in aquatic products economy, rapid and accurate, specific, sensitive and simple detection method, improve the medical health examination, disease prevention, aquatic products processing and import and export inspection and other departments of the detection quality and efficiency.

【技术实现步骤摘要】
基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法
本专利技术属于食品病害微生物检测领域，具体涉及一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP)是革兰氏阴性嗜盐细菌，隶属弧菌科中的弧菌属。它是近海的鱼类、虾类、蟹类、贝类等海产品中的重要的食源性致病菌之一，属人畜共患病菌，在水产品中的污染状况非常严重，是沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病原菌。为确保食品安全，保护人民身体健康，欧盟、美国等发达国家对水产品中的副溶血性弧菌做出了明确的规定，如欧盟规定副溶血性弧菌不得检出，而美国规定＜1×104/g。我国已将该菌列为主要的检验或监测对象。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。自2001年以来，副溶血性弧菌性食物中毒爆发已经成为中国最常见的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中毒的起数和人数一直处于第一位。使用传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确，但检测周期长、工作量大，繁琐费时。不仅如此，低水平的病原菌污染，食品加工后导致菌体的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得传统的检测方法受到了一定的限制，因此，急需一些灵敏度更高、特异性更强、简便、快捷的水产品安全检测技术，以及时发现致病微生物，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。科技创新产生了一系列新型的检测方法，如核酸分子扩增检测技术、免疫检测、生物传感等技术，为微生物、病毒的检测提供了新的手段，在食品安全检测中发挥了重要作用。免疫荧光技术(FAT)、酶联免疫吸附(ELISA)、分子检测技术(PCR、RFLP、AFLP、RAPD等)已经被用来检测各种水产病原。尽管目前已有多种微生物的检测方法，但大多需要较高的实验室条件，且操作复杂、耗时，只有熟练掌握了其操作技巧的人员才能完成测试，不适合在基层推广和使用，在发展中国家及我国临床条件有限的地区应用受到限制。因此，有必要建立水产品中副溶血性弧菌经济、快速、准确、特异、灵敏、简便的检测诊断方法，提高医学卫生检验、疾病防控、水产品加工和进出口检验等部门的检测质量和效率。核酸等温扩增技术(isothermalnucleicacidamplificationtechnology)可在某一特定的温度下扩大特定DNA或RNA片段的拷贝数。与常规PCR技术相比，在遗传相关疾病和微生物检测中，核酸等温扩增技术可通过加热模块、水浴槽等简单非专业设备完成，对仪器要求大大简化，反应时间大幅缩短，因而更能满足现代分子检测技术“快速简便”的需求，具有非常大的实际应用价值。目前利用纳米金探针作为特异DNA识别的研究层出不穷。纳米金因其高的比表面积、稳定的表面物理化学性质，特别适合作为分子识别反应的界面。将大量的识别分子固定在纳米金表面，可实现一系列的反应信号放大功能。此外，由于纳米金具有独特的等离子体共振光学性质，并随粒子形貌、表面修饰物、粒子间距、溶剂介电常数变化，表现为溶液颜色的显著改变，为实现基于纳米金探针的简便、灵敏、快速可视化分析提供了理论基础，使得构建一系列的溶液内纳米传感过程成为可能。基于此，本专利技术将近年最新发展起来的新型的分子扩增反应(环介导等温扩增法)与具有优异的表面特性与光学性能的纳米材料(纳米金)结合起来，开发可现场快速检测副溶血性弧菌的检测方法。已有的等温分子扩增方法多依靠荧光比色检测手段，扩增时间较长，且多为有毒化学探针，本专利技术的方法实现了直接的可视化检测结果判定，并提高了对分子扩增反应的响应灵敏度，缩短了检测时间，摆脱了对荧光比色试剂以及荧光检测仪器的依赖性，可大幅降低检测成本，提高检测操作的安全性能。服务于水产品质量安全与疾病防控等领域，并为其他特定的病原微生物在食品质量安全与疾病防控检测手段提供技术参考。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对快速简便检测副溶血性弧菌的需求，提供了一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法。具体来说，是提供一种基于纳米金与等温核酸扩增反应检测副溶血性弧菌tlh基因的试剂及其制备方法，并提供基于该试剂在快速可视化检测中的应用方法。建立了水产品中副溶血性弧菌经济、快速、准确、特异、灵敏、简便的检测诊断方法，提高医学卫生检验、疾病防控、水产品加工和进出口检验等部门的检测质量和效率。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，所述方法包括如下步骤：S1、制备链霉亲和素标记的纳米金；S2、对样品进行采集、增菌后，提取DNA；S3、以所述DNA为扩增模板进行环介导等温扩增；S4、取所述链霉亲和素标记的纳米金加入步骤S3扩增完成的反应溶液体系，反应后观察反应体系溶液；如反应体系溶液产生明显的由红向蓝的变化过程，则代表样品中检测出了副溶血性弧菌，如反应体系溶液未发生由红向蓝的变色过程，则代表样品中无副溶血性弧菌。优选的，步骤S1中，链霉亲和素标记的纳米金的制备包括如下步骤：A1、调节纳米金溶液在450nm处的吸光度值在1.5～2.0；A2、以0.1mol/L的K2CO3或0.1mol/L的HCl溶液将纳米金溶液调节至pH＝7～8；A3、将链霉亲和素稀释成一系列5-40μg/mL溶液，每1mL的纳米金溶液中分别加入0.1mL，混匀静置后，加入0.1mL10％的NaCl溶液，混匀静置，随着链霉亲和素的用量的增加，纳米金溶液由蓝色变为红色；选择由蓝色变为红色的链霉亲和素用量1.1倍作为最佳蛋白标记比例；A4、每10mL的经步骤A1和A2调节好的纳米金溶液中，加入所述最佳蛋白标记比例的链霉亲和素溶液，混匀后加入0.1mL10％PEG20000溶液再次混匀；A5、离心分离后，将底层悬浮液用0.5mg/mLPEG20000溶液重新离心沉淀，恢复后加入0.1mg/mL叠氮化钠后冷藏保存待用。优选的，步骤S2中，所述采集、增菌具体为：以无菌操作取样品可食部分每25g，加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225mL，均质处理，制备成1∶10的样品匀液，于36℃±1℃培养，得增菌液。优选的，步骤S2中，所述提取包括：将过夜培养的增菌液混匀后静置，吸取菌悬液每5mL，加入无菌离心管中，以8000～12000r/min离心，弃去上清液，加入0.5～2mLTZ裂解液悬浮菌体。优选的，所述TZ裂解液的配制包括：2.0％TritonX-100，2.5mg/mL的叠氮化钠，0.1mol/LTris-HC1缓冲液，pH8.0；沸水浴10min，置冰上10min，然后10000r/min离心5min，冷冻保存待用。优选的，所述环介导等温扩增中采用的针对副溶血性弧菌的tlh基因的特异性标记引物的序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示；采用的针对副溶血性弧菌的tlh基因的探针的序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示.优选的，所述环介导等温扩增体系总体积为40μL，除所述引物和探针序列外，还包括如下试剂：各2.0μmol/L的FIP和BIP、各0.3μmol/L的F3和B3、1μmol/LLF和LB、1×恒温缓冲液(Tris-HCl，20mM，pH8.8)、1.2mol/L的甜菜碱、7mmol/L的MgSO4、2.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、制备链霉亲和素标记的纳米金；S2、对样品进行采集、增菌后，提取DNA；S3、以所述DNA为扩增模板进行环介导等温扩增；S4、取所述链霉亲和素标记的纳米金加入步骤S3扩增完成的反应溶液体系，反应后观察反应体系溶液；如反应体系溶液产生明显的由红向蓝的变化过程，则代表样品中检测出了副溶血性弧菌，如反应体系溶液未发生由红向蓝的变色过程，则代表样品中无副溶血性弧菌。

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、制备链霉亲和素标记的纳米金；S2、对样品进行采集、增菌后，提取DNA；S3、以所述DNA为扩增模板进行环介导等温扩增；S4、取所述链霉亲和素标记的纳米金加入步骤S3扩增完成的反应溶液体系，反应后观察反应体系溶液；如反应体系溶液产生明显的由红向蓝的变化过程，则代表样品中检测出了副溶血性弧菌，如反应体系溶液未发生由红向蓝的变色过程，则代表样品中无副溶血性弧菌。2.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，步骤S1中，链霉亲和素标记的纳米金的制备包括如下步骤：A1、调节纳米金溶液在450nm处的吸光度值在1.5-2.0；A2、以0.1mol/L的K2CO3或0.1mol/L的HCl溶液将纳米金溶液调节至pH＝7～8。A3、将链霉亲和素稀释成一系列5～40μg/mL溶液，每1mL的纳米金溶液中分别加入0.1mL，混匀静置后，加入0.1mL10％的NaCl溶液，混匀静置，随着链霉亲和素的用量的增加，纳米金溶液由蓝色变为红色；选择由蓝色变为红色的链霉亲和素用量1.1倍作为最佳蛋白标记比例；A4、每10mL的经步骤A1和A2调节好的纳米金溶液中，加入所述最佳蛋白标记比例的链霉亲和素溶液，混匀后加入0.1mL10％PEG20000溶液再次混匀；A5、离心分离后，将底层悬浮液用0.5mg/mLPEG20000溶液重新离心沉淀，恢复后加入0.1mg/mL叠氮化钠后冷藏保存待用。3.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述提取包括：将过夜培养的增菌液混匀后静置，吸取菌悬液每5mL，加入无菌离心管中，以8000～12000r/min离心，弃去上清液，加入0.5～2mLTZ裂解液悬浮菌体。4.根据权利要求3所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，所述TZ裂解液的配制包括：2.0％TritonX-100，2.5mg/mL的叠氮化钠，0.1mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.0；沸水浴10min，置冰上10min，然后10000r/min离心5min，冷冻保存待用。5.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增中采用的针对副溶血性弧菌的tlh基因的特异性标记引物的序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示；采用的针对副...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔聪，沈晓盛，王媛，史永富，刘志东，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31