在重组宿主中生产甜菊醇糖苷制造技术

本发明专利技术涉及用于生产甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的重组微生物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在重组宿主中生产甜菊醇糖苷
本公开内容涉及在重组宿主中重组生产甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体。特别地，本公开内容涉及在重组宿主中生产包含甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷C(RebC)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷M(RebM)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜尔可苷A，或其异构体的甜菊醇糖苷。相关技术描述甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的。甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂(tabletopsweeter)或者作为烘培中糖的家用替代品单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯巴甜、糖精和三氯半乳蔗糖(sucralose))。甜菊提取物(steviaextract)是可从多年生灌木甜菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于商业生产甜菊提取物。各种程度纯化的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及在共混物中或单独地作为佐餐甜味剂。图1中显示了几种甜菊醇糖苷的化学结构，包括二萜甜菊醇和多种甜菊醇糖苷。甜菊植物的提取物通常包含有助于甜味的甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量通常在不同的生产批次之间不同。由于从甜菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷已被证明是劳动密集型的和低效的，因此仍然需要可以高产率积累所需甜菊醇糖苷(如RebD和RebM)的重组生产系统。还需要在重组宿主中改进甜菊醇糖苷的生产以用于商业用途。
技术实现思路
在上述背景下，本专利技术提供了相对于现有技术的某些优点和进步。尽管本文公开的专利技术不限于特定的优点或功能，但是本专利技术提供了这样的重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；(b)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；和/或(c)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体。本专利技术还提供了这样的重组宿主，其包含：(a)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；(b)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；(c)编码对映贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；(d)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；(e)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；和(f)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇。在本文所公开的重组宿主的一个方面中，(a)所述KO多肽包含这样的KO多肽：其与SEQIDNO：72或SEQIDNO：75所示的氨基酸序列具有至少60％的同一性；与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列具有65％的同一性；与SEQIDNO：70、SEQIDNO：71或SEQIDNO：79所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性；与SEQIDNO：77所示的氨基酸序列具有至少40％的同一性；或与SEQIDNO：78所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；(b)所述CPR多肽包含这样的CPR多肽：其与SEQIDNO：69、SEQIDNO：74、SEQIDNO：76或SEQIDNO：87所示氨基酸序列具有至少70％的同一性；与SEQIDNO：73所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性；与SEQIDNO：22所示的氨基酸序列具有至少85％的同一性；与SEQIDNO：28所示的氨基酸序列具有至少65％的同一性；或与SEQIDNO：98所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；和/或(c)所述KAH多肽包含这样的KAH多肽：其与SEQIDNO：82所示的氨基酸序列具有至少40％同一性；与SEQIDNO：91所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；或与SEQIDNO：68所示的氨基酸序列具有至少60％的同一性。本专利技术还提供了一种重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码与SEQIDNO：75所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的KO多肽的基因；(b)编码与SEQIDNO：82所示氨基酸序列具有至少40％同一性的KAH多肽的基因；和/或(c)编码与SEQIDNO：98所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的CPR多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体。本专利技术还提供了一种重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码与SEQIDNO：70所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的KO多肽的基因；(b)编码与SEQIDNO：82所示氨基酸序列具有至少40％同一性的KAH多肽的基因；和/或(c)编码与SEQIDNO：98所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的CPR多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体。在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述宿主还包含编码与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的KO多肽的基因。在本文所公开的重组宿主的另一个方面中，所述重组宿主还包含编码与SEQIDNO：68所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的KAH多肽的基因。在本文所公开的重组宿主的另一个方面中，所述重组宿主还包含编码与SEQIDNO：79所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的KO多肽的基因。在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述宿主还包含以下的一种或更多种：(a)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；(b)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；和/或(c)编码对映贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体。在本文所公开的重组宿主的一些方面中，(a)所述GGPPS多肽包含与SEQIDNO：49所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；(b)所述CDPS多肽包含与SEQIDNO：37所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；和/或(c)所述KS多肽包含与SEQIDNO：6所示的氨基酸序列具有至少40％同一性的多肽。在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述重组宿主还包含编码内质网膜多肽的基因。在本文所公开的重组宿主的另一个方面中，所述内质网膜多肽包含与SEQIDNO：114所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的皮层ER蛋白2(ICE2)多肽的遗传物(Inheritance)。在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述KO多肽是融合构建体。在另一个方面中，所述融合构建体包含与SEQIDNO：118或SEQIDNO：120所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽。在另一个方面中，所述融合构建体与SEQIDNO：100、SEQIDNO：102、SEQIDNO：104、SEQIDNO：106、SEQIDNO：108、SEQIDNO：110或SEQIDNO：112所示的氨基酸序列具有至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；(b)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；和/或(c)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体.

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.09 US 62/048,178;2015.01.14 US 62/103,547;1.重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；(b)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；和/或(c)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体.2.重组宿主，其包含：(a)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；(b)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；(c)编码对映贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；(d)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；(e)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；和(f)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇.3.权利要求1或2所述的重组宿主，其中：(a)所述KO多肽包含这样的KO多肽：其与SEQIDNO：72或SEQIDNO：75所示的氨基酸序列具有至少60％的同一性；与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列具有至少65％的同一性；与SEQIDNO：70、SEQIDNO：71或SEQIDNO：79所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性；与SEQIDNO：77所示的氨基酸序列具有至少40％的同一性；或与SEQIDNO：78所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；(b)所述CPR多肽包含这样的CPR多肽：其与SEQIDNO：69、SEQIDNO：74、SEQIDNO：76或SEQIDNO：87所示氨基酸序列具有至少70％的同一性；与SEQIDNO：73所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性；与SEQIDNO：22所示的氨基酸序列具有至少85％的同一性；与SEQIDNO：28所示的氨基酸序列具有至少65％的同一性；或与SEQIDNO：98所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；和/或(c)所述KAH多肽包含这样的KAH多肽：其与SEQIDNO：82所示的氨基酸序列具有至少40％的同一性；与SEQIDNO：91所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；或与SEQIDNO：68所示的氨基酸序列具有至少60％的同一性.4.重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码与SEQIDNO：75所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的KO多肽的基因；(b)编码与SEQIDNO：82所示氨基酸序列具有至少40％同一性的KAH多肽的基因；和/或(c)编码与SEQIDNO：98所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的CPR多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体.5.重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码与SEQIDNO：70所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的KO多肽的基因；(b)编码与SEQIDNO：82所示氨基酸序列具有至少40％同一性的KAH多肽的基因；和/或(c)编码与SEQIDNO：98所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的CPR多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体.6.权利要求4或5所述的重组宿主，其中所述宿主还包含编码与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的KO多肽的基因.7.权利要求4-6中任一项所述的重组宿主，其中所述宿主还包含编码与SEQIDNO：68所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的KAH多肽的基因.8.权利要求4-7中任一项所述的重组宿主，其中所述宿主还包含编码与SEQIDNO：79所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的KO多肽的基因.9.权利要求1或3-8中任一项所述的重组宿主，其中所述宿主还包含以下的一种或更多种：(a)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；(b)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；和/或(c)编码对映贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体.10.权利要求9所述的重组宿主，其中：(a)所述GGPPS多肽包含与SEQIDNO：49所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；(b)所述CDPS多肽包含与SEQIDNO：37所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；和/或(c)所述KS多肽包含与SEQIDNO：6所示的氨基酸序列具有至少40％同一性的多肽.11.权利要求1至10所述的重组宿主，其中所述宿主还包含编码内质网膜多肽的基因.12.权利要求11所述的重组宿主，其中所述内质网膜多肽包含与SEQIDNO：114所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的皮层ER蛋白2(ICE2)多肽的遗传物.13.权利要求1至10中任一项所述的重组宿主，其中所述KO多肽是融合构建体.14.权利要求13所述的重组宿主，其中所述融合构建体包含与SEQIDNO：118或SEQIDNO：12...

【专利技术属性】
技术研发人员：海伦妮·伦德·罗伯特森，伊本·努德马克·安诺生，亚当·马修·塔科斯，水·川·利姆·哈尔维尔，弗兰切斯卡·安布里，马努埃尔·基罗斯·阿森西奥，迈克尔·达尔埃格德·米克尔森，延斯·霍顿拉森，韦罗尼克·杜尚，简·丹诺·迪埃凯，西蒙·卡尔森，尼纳·尼科利纳·拉斯穆森，埃斯本·哈尔克谢尔·汉森，
申请(专利权)人：埃沃尔瓦公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH