一种重组菌株及其应用和制备9‑氟甾体激素前体的方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种重组菌株及其应用和制备9‑氟甾体激素前体的方法。本发明专利技术所述重组菌株在分枝杆菌或大肠杆菌中转化有包含kstD、kstD3、kstDM中一种或两种以上基因的质粒；或在分枝杆菌或大肠杆菌基因组上整合有kstD、kstD3、kstDM中一种或两种以上基因。本发明专利技术通过引入外源基因kstD、kstD3和kstDM，构建重组分枝杆菌或大肠杆菌，并使用重组菌株细胞裂解液生产甾药前体，所获得的9β,11β‑环氧‑17α,21‑二羟基‑16β‑甲基孕‑1,4‑二烯‑3,20‑二酮具有极高转化率，同时阐明了生物转化的反应机理，为将来的工业化生产提供理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法
本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法。
技术介绍
甾体激素药物作为抗生素之后的第二大类药物广泛用于治疗和预防许多疾病，例如消炎，利尿，避孕，促孕，抗雄激素和抗癌剂等。甾药的高需求促生了另一重要产业的蓬勃发展—甾药中间体(甾药前体)的提取与制备。微生物法制备甾药前体的工艺因其环境污染小，反应步骤少、产品损失低、收率高等突出优势，广泛应用于工业生产。近年来，通过微生物的生物转化对甾体化合物进行脱氢、氧化、羟化及侧链切割等反应而获得多种药物中间体。例如，9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(式Ⅳ)是生产9-氟甾体激素(如地塞米松，倍他米松，曲安西龙等)的关键前体，以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(式Ⅰ)为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。但是关于9(11)-环氧甾体生物转化的研究还未见报道，反应机制也没有完全阐明。目前，对于甾体化合物的生物转化大多都基于基因工程改造的微生物或分离纯化的酶催化。这些方法可以使甾体化合物的转化率有一定的提高，但甾体底物溶解度差、微生物发酵过程染菌以及分离纯化酶的高成本都是制约其工业应用的关键问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组菌株，使得所述重组分支杆菌能够显著提高9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮的转化率；本专利技术的另一个目的在于提供所述重组菌株在生产9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的应用；本专利技术的第三个目的在于提供基于所述重组菌株生产9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种重组菌株，在分枝杆菌或大肠杆菌中转化有包含kstD、kstD3、kstDM中一种或两种以上基因的质粒；或在分枝杆菌或大肠杆菌基因组上整合有kstD、kstD3、kstDM中一种或两种以上基因。针对现有甾体化合物的生物转化工艺中缺少以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(式Ⅰ，以下简称Ⅰ)为底物合成9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(式Ⅳ，以下简称Ⅳ)的方法，本专利技术通过在分枝杆菌或大肠杆菌中转化表达kstD、kstD3和kstDM基因的质粒，以重组菌株的细胞裂解液进行生物转化，最终获得具有较高转化率的甾药前体Ⅳ。作为优选，所述kstD、kstD3、kstDM均来源于新金分枝杆菌Mycobacteriumneoaurum。在本专利技术具体实施过程中，所述kstD、kstD3均来源于新金分枝杆菌MycobacteriumneoaurumATCC25795(kstDGenbankID：GQ476982，kstD3GenbankID：KF772210)，序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。所述kstDM来源于新金分枝杆菌MycobacteriumneoaurumNwIB-01(kstDMGenbankID：GQ228843)，序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术中所转化的质粒可使用本领域各种常用质粒，在具体实施过程中，本专利技术所述质粒采用商用pMV261质粒，购于Biosci公司。在本专利技术具体实施过程中，所述分枝杆菌为保藏编号为CGMCCNo.13532的分枝杆菌，分类命名为Mycobacteriumsp.，于2017年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE)，可购买或根据本领域常规构建方法构建获得。采用本专利技术所述重组菌株的细胞裂解液对底物Ⅰ进行转化，重组分枝杆菌可获得至少60％转化率的Ⅳ，在对反应体系的缓冲液pH值优化后，Ⅳ的转化率最高可达到90％以上。重组大肠杆菌可获得至少45％转化率的Ⅳ，在最高可达到80％左右。基于上述优异的技术效果，本专利技术提出了所述重组菌株或/和其细胞裂解液在制备以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯为底物合成9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的应用。与此同时，基于所述重组菌株在生物转化方面的优异表现，本专利技术还提供了一种制备9-氟甾体激素前体(即Ⅳ)的方法，包括：步骤1、制备所述重组菌株的细胞裂解液；步骤2、向步骤1中的细胞裂解液加入底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。其中，作为优选，步骤1包括：步骤1.1、将所述重组菌株进行扩繁，然后加入氢化可的松诱导培养，收集菌体用缓冲液(如PBS)洗涤并重悬；步骤1.2、将重悬后的菌体细胞超声破碎，获得所述重组菌株的细胞裂解液。在本专利技术具体实施过程中，步骤1.1为：将所述重组菌株接种于5mL液体培养基(甘油10g/L、酵母提取物10g/L、磷酸氢二铵1.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、吐温802.5g/L、无水硫酸镁10g/L、硫酸亚铁0.5g/L、硫酸锌0.2g/L，pH7.2-7.3；固体培养基添加15g/L琼脂粉)中30℃过夜培养，然后转移至50mL新鲜液体培养基中，在30℃、200r/min培养至OD600为0.5-0.6，然后添加终浓度为0.1g/L的氢化可的松在30℃、200r/min诱导培养24h，收集菌体PBS缓冲液洗涤并重悬至OD600为2.0。在本专利技术具体实施过程中，所述缓冲液的pH值为6、6.5、7、7.5或8，所述PBS缓冲液可采用KH2PO4/K2HPO4体系的PBS缓冲液，通过调整两者的比例来控制缓冲液的pH值。在对pH值的试验中发现，缓冲液pH值对转化率有明显的影响，其中以pH值为7.5时转化率最高。在本专利技术具体实施过程中，步骤1.2为：将重悬后的菌体细胞在500W功率下超声破碎，以每破碎5s间歇5s的方式进行，共20min，全程冰上操作，获得所述重组菌株的细胞裂解液。作为优选，步骤2为：向步骤1中的细胞裂解液加入底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯、PMS(吩嗪硫酸甲酯)和助溶剂(如乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、Tween80或Tween20)在摇床上进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。在本专利技术具体实施过程中，步骤2为：向步骤1中的细胞裂解液加入终浓度为1g/L的底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，2.5mM的PMS和7％的乙醇，在30℃、200r/min摇床上进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组菌株，其特征在于，在分枝杆菌或大肠杆菌中转化有包含kstD、kstD3、kstDM中一种或两种以上基因的质粒；或在分枝杆菌或大肠杆菌基因组上整合有kstD、kstD3、kstDM中一种或两种以上基因。

【技术特征摘要】
1.一种重组菌株，其特征在于，在分枝杆菌或大肠杆菌中转化有包含kstD、kstD3、kstDM中一种或两种以上基因的质粒；或在分枝杆菌或大肠杆菌基因组上整合有kstD、kstD3、kstDM中一种或两种以上基因。2.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，所述kstD、kstD3、kstDM均来源于新金分枝杆菌Mycobacteriumneoaurum。3.根据权利要求2所述重组菌株，其特征在于，所述kstD、kstD3均来源于新金分枝杆菌MycobacteriumneoaurumATCC25795。4.根据权利要求2所述重组菌株，其特征在于，所述kstDM来源于新金分枝杆菌MycobacteriumneoaurumNwIB-01。5.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，所述质粒为pMV261质粒。6.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，所述分枝杆菌为保藏编号为CGMCCNo.13532的分枝杆菌。7.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE)。8.权利要求1-7任意一项所述重组菌株或/和其细胞裂解液在制备以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯为底物合成9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的应用。9.一种制备9-氟甾体激素前体的方法，其特征在于，包括：步骤1、制备权利要求1-7任意一项所述重组菌株的细胞裂解液；步骤2、向步骤1中的细胞裂解液加入底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。10.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋浩，秦梦菲，孙鸿，曹英秀，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12