一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送工程菌株的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的基因工程菌株的构建方法及其应用。构建方法是，将铜绿假单胞菌PAK菌株基因组中4种毒力因子exoS,exoT,exoY,ndk基因删除，使其对哺乳动物细胞无细胞毒性；进一步从染色体上删除抑制细菌III型分泌系统(T3SS)的popN基因，使其T3SS介导的蛋白质注入量显著提高，从而构建出工程菌株Δ5。本发明专利技术构建的工程菌株Δ5可用于对多种哺乳动物细胞系实施蛋白质递送，进行基因编辑，细胞重编程，蛋白质功能研究等工作。可实施递送的细胞类型广泛，包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、多能干细胞等。

【技术实现步骤摘要】
一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送工程菌株的构建方法及应用
本专利技术属于生物
，涉及的是一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的铜绿假单胞菌基因工程菌株的构建方法及其应用。
技术介绍
目前应用最普遍的细胞内蛋白质导入技术是基于DNA/RNA的转染法，其2大缺陷是：①外源核酸片段有可能随机整合到基因组中而诱发癌变或其他不可预见的后果。②外源蛋白质的表达一旦启动无法有效地终止。如果能将兴趣分子直接以“蛋白质”的形式输送到靶细胞内，则可以克服以上缺点。首先，蛋白质导入避免了外源DNA/RNA带来的基因组不稳定性。其次，由于外源蛋白质进入细胞内会被胞内自身的蛋白酶降解，使其作用时间可控。目前蛋白质导入方法已见多项报道，如显微注射，转染试剂(TransfectionReagent)和蛋白转移结构域(ProteinTranslocationDomain)介导的蛋白导入法，但这些种方法的蛋白质递送效率都很低，而且转染试剂对靶细胞有很大毒性，后者则仅限于小分子量蛋白质的导入。此外，上述方法均涉及对目标蛋白的分离纯化，其操作繁琐且成本高，不适用于大规模生产。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)属于假单胞菌科、假单胞菌属，革兰式阴性细菌。其分布广泛，在自然界(土壤、水和空气)、植物表面、人体的皮肤、肠道和呼吸道中均有分布。铜绿假单胞菌的III型蛋白分泌系统(TypeIIIsecretionsystem，T3SS)是其表面形成的一种针状复合物结构，可穿透真核细胞的细胞膜从而将细菌的毒素蛋白直接注入到靶细胞内，且不涉及细菌进入到靶细胞内，是自然界存在的一种高效的蛋白质注入机制。铜绿假单胞菌PAK菌株具有3种主要的毒素蛋白：ExoS，ExoT和ExoY，铜绿假单胞菌利用其T3SS将这些毒素蛋白注入靶细胞内有助于该菌在宿主环境中的存活。近年来发现ndk基因编码产物核苷二磷酸激酶(NDK)，是另一种通过T3SS注入到细胞中的毒力因子，NDK的注入可以被前3种主要的效应因子所抑制，在ExoS、ExoT和ExoY缺失的菌株中，NDK的注入量显著提高，并产生明显的细胞毒性。popN基因编码产物可以抑制细菌T3SS蛋白质注入，popN基因突变子在非诱导条件下便能够分泌效应蛋白,显示popN基因编码的蛋白对T3SS具有负调控作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种无细胞毒性、且具有高T3SS活性的铜绿假单胞菌基因工程菌株，通过该菌的T3SS将外源蛋白质注入到哺乳动物细胞中，专利技术一种可应用于哺乳动物细胞蛋白质递送的工程菌株的构建方法及应用。本专利技术的技术方案一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的基因工程菌株的构建方法，将铜绿假单胞菌PAK基因组中4个毒力因子基因exoS,exoT,exoY,ndk删除，使铜绿假单胞菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，获得菌株Δ4；将菌株Δ4中抑制III型蛋白分泌系统(T3SS)的popN基因从染色体上删除，使菌株Δ4的T3SS介导的蛋白质注入量显著提高，最终获得工程菌株Δ5。本专利技术同时提供了所述方法制备的铜绿假单胞菌基因工程菌株Δ5的应用：所述应用是指菌株Δ5能够用于对多种哺乳动物细胞系实施蛋白质递送；即通过将目标蛋白与菌株Δ5的T3SS分泌信号肽ExoS54融合表达于表达载体pExoS54中，当携带有该表达载体的Δ5菌株与哺乳动物细胞共同培养的时候，Δ5的T3SS被激活，目标蛋白与T3SS信号融合蛋白大量表达，在T3SS分泌信号肽ExoS54的引导下将目标蛋白高效地注入到哺乳动物细胞当中。所注入的目标蛋白可以为转录因子，酶(如核酸酶TALEN，Cas9，Cre重组酶)，疫苗，结构蛋白，或毒力因子等。所述的细菌感染细胞的最佳条件是：随着感染系数(MOI)和侵染时间的增加，蛋白质的注入量也相应增加；当MOI为50，侵染4h，为最合适的条件。所述的工程菌株Δ5能够应用于各种哺乳动物细胞系，包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、免疫细胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞(iPS细胞)。所述的工程菌株Δ5适用于多领域研究工作，包括干细胞定向分化，细胞重编程，细胞基因编辑，蛋白质功能研究。本专利技术的有益效果本专利技术利用基因改造的铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统作为一种蛋白质递送的工具，能够简单、高效地将外源蛋白质注入到哺乳动物细胞内，不涉及DNA/RNA随机整合导致的基因组不稳定性，且适合大规模生产。【附图说明】图1.基因敲除方法示意图。图2.LDH法检测菌株Δ5对多种哺乳动物细胞系的细胞毒性。图3.表达载体pExoS54-mApple的构建。图4.WesternBlot检测Δ5菌株对HeLa细胞的mApple蛋白注入量。图5.免疫荧光检测Δ5菌株对HeLa细胞的mApple蛋白递送。图6.Flowcytometry检测Δ5菌株对HeLa细胞的mApple蛋白注入效率。【具体实施方式】本专利技术使用的菌种和质粒野生型铜绿假单胞菌PAK为实验室保存；铜绿假单胞菌Δ4(PAK背景下敲除染色体上的exoS、exoT、exoY和ndk基因)和Δ5(Δ4背景下敲除popN基因)为本研究构建；大肠杆菌DH5α/λpir用于分子克隆，本实验室保存；大肠杆菌S17-1/λpir用于接合转移，本实验室保存；基因敲除载体pEX18Tc，融合蛋白表达载体pExoS54，本实验室保存。本专利技术使用的哺乳动物细胞Hela，A549，鼠胚胎干细胞(mESC)J1和人胚胎干细胞(hESC)H9均为本实验室保存。本专利技术使用的试剂DNAMarker、限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP来自于Takara公司；T4DNA连接酶(Promega)、酵母提取物物(Yeastextract)和胰蛋白胨(Tryptone)购自英国Oxoid公司；蔗糖(Sucrose)和二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品；琼脂糖购自BIOWEST；琼脂粉(Bacto-agar)、四环素和卡那霉素购自自生工生物工程(上海)股份有限公司；基因组提取试剂盒(EasyPureGenomicDNAExtractionKit)为全氏金公司产品；质粒小提试剂盒(PlasmidMiniPrepKit)为美国Axygen公司产品；DNA纯化试剂盒(DNAclean&Concentrator)和DNA胶回收试剂盒(ZymocleanGelDNARecoveryKit)为美国Zymoresearch公司产品。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒购自Promega公司。基因敲除质粒的构建1)以PAK菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到exoS、exoT、exoY、ndk和popN的上下游1-kb左右的同源臂片段。在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物的大小及大致浓度，并切胶回收同源臂DNA片段。2)取上述PCR产物，分别用合适的限制性内切酶进行酶切，然后克隆到具有相应粘性末端的pEX18Tc质粒上，连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂布在含110μg/mL四环素(Tc)的LB平板上筛选转化子，PCR和质粒酶切对转化子进行鉴定，得到基因敲除质粒pEX18Tc-exoS、pEX18Tc-exoT、pEX18Tc-exoY、pEX18Tc-ndk和pEX18Tc-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的基因工程菌株的构建方法，其特征是：将铜绿假单胞菌PAK基因组中4个毒力因子exoS,exoT,exoY,ndk基因删除，使铜绿假单胞菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，获得基因敲除株Δ4；将Δ4菌株中抑制III型蛋白分泌系统(T3SS)的popN基因从染色体上删除，使细菌T3SS介导的蛋白质注入量显著提高，最终获得工程菌株Δ5。

【技术特征摘要】
1.一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的基因工程菌株的构建方法，其特征是：将铜绿假单胞菌PAK基因组中4个毒力因子exoS,exoT,exoY,ndk基因删除，使铜绿假单胞菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，获得基因敲除株Δ4；将Δ4菌株中抑制III型蛋白分泌系统(T3SS)的popN基因从染色体上删除，使细菌T3SS介导的蛋白质注入量显著提高，最终获得工程菌株Δ5。2.权利要求1所述方法构建的铜绿假单胞菌基因工程菌株Δ5的应用，其特征在于：所述应用是指菌株Δ5能够用于对多种哺乳动物细胞系实施蛋白质递送；即通过将目标蛋白与T3SS分泌信号肽ExoS54融合表达于表达载体pExoS54中，当携带有该表达载体的Δ5菌株与哺乳动物细胞共同培养的时候，Δ5的T3SS被激活，目标蛋白与ExoS54融合表达，随后在ExoS54信号肽的引导下，将目标蛋白注入到...

【专利技术属性】
技术研发人员：白芳，金守光，靳永新，刘颖，李振鹏，吴卫辉，程志辉，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12