用于转基因表达的合成启动子构建体制造技术

本发明专利技术涉及用于在植物中增强的转基因表达的合成启动子构建体和包含所述合成启动子构建体的表达盒。所述表达盒可包括用于改善的表达、所表达的蛋白的稳定性或所表达的蛋白的有效纯化的各种元件，所述元件包括信号序列、用于所述靶蛋白的释放的蛋白酶裂解位点、用于将所表达的蛋白运输至各种植物隔间的运输肽和/或各种标签。本发明专利技术还涉及在所述合成启动子构建体和表达盒的使用下，在植物中表达转基因蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于转基因表达的合成启动子构建体相关申请的交叉引用本申请要求在2014年5月19日提交的南非临时专利申请号2014/03606的权益，此申请的全部内容以引用的方式并入本文。
本专利技术涉及植物中基因表达的调节。
技术介绍
植物中不可靠和低水平的组成型转基因表达是用于作物改良和生物制药的植物生物技术的主要挑战之一。若干个分子元件可发挥作用，但转基因的低水平表达主要是由于弱的启动子。目前，可用的启动子的选择是有限的，并且这些启动子中的大多数基于常规野生型启动子元件，其中花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)是最广泛使用的启动子中的一种。然而，存在对驱动高于其能够通过野生型甚至修改版本的CaMV35S的水平的转基因表达的需要，特别是对于生物制药应用。
技术实现思路
本文公开了用于增强植物中的转基因表达的合成启动子构建体；包含合成启动子构建体的表达盒；和使用合成启动子构建体在植物中表达转基因蛋白的方法。本文提供了包含调节核酸序列的分离的多核苷酸，所述调节核酸序列(a)与SEQIDNO:1、3、4或18中任一个示出的多核苷酸序列或其功能等价片段具有至少95％或更多的序列同一性，或(b)在严格条件下与SEQIDNO:1、3、4或18中任一个示出的多核苷酸序列的互补序列杂交。在一些实施方案中，调节核酸序列与SEQIDNO:1、3、4或18中任一个或其功能等价片段具有95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，调节核酸序列与SEQIDNO:1、3、4或18中任一个或其功能等价片段具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，调节核酸序列或其功能等价片段含有选自由以下组成的组的一个或多个基序：SORLREP2AT、ASF1MOTIFCAMV、AS1CAMV、ATRICHPSPETE、GT1MOTIFPSRBCS、INRNTPSADB、CTRMCAMV35S、-10PEHVPSBD、LTREATLTI78、CBFHV、DRECRTCOREAT、LTRECOREATCOR15、MYCCONSENSUSAT、LRENPCABE、SORLIP1AT、BOXIIPCCHS、CCA1ATLHCB1、CGF1ATCAB2、GT1CONSENSUS、IBOXCORE、RBCSCONSENSUS、CIACADIANLELHC、GATABOX、SORLIP5AT以及CACTFTPPCA1。分离的多核苷酸还可包含一个或多个限制酶位点以用于插入与调节核酸序列异源的第二核酸序列，使得插入的第二核酸序列将可操作地连接到调节核酸序列，并且调节核酸序列能够指导第二可操作连接的核酸序列的转录。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与调节核酸序列异源的靶蛋白，并可操作地连接到调节核酸序列。例如，第二核苷酸序列可编码可用于食品或饮料工业、制药工业(例如作为疫苗或治疗性蛋白)、农业或化学工业的靶蛋白。在一些实施方案中，第二核苷酸序列编码治疗性蛋白。在一些实施方案中，第二核苷酸序列编码(A)肺表面活性蛋白-B(SP-B)前蛋白原或其功能片段或类似物；(B)SP-B成熟肽或其功能片段或类似物；或(A)和(B)两者的一种或多种拷贝。在一些实施方案中，分离的多核苷酸还包含终止子序列，例如选自Nos聚A、35S聚A、RbcS1终止子或本领域的技术人员已知的另一种终止子的终止子序列。调节核酸序列或其功能等价片段可以可操作地连接到终止子序列。分离的多核苷酸还可包含以下元件中的一个或多个：(i)编码信号肽的多核苷酸序列，诸如equistatin的信号肽区或烟草硫堇(Nicotianatabacumthionin)(NtSP)的信号肽区；(ii)编码运输肽的多核苷酸序列，诸如内质网(ER)-运输肽，例如SEKDEL(SEQIDNO:34)、KDEL(SEQIDNO:35)、HDEL(SEQIDNO:36)；油体-运输肽(例如油质蛋白)、蛋白贮藏液泡-运输肽(例如，来自例如大麦凝集素、菜豆的菜豆蛋白或大豆β-伴大豆球蛋白α'子单元的液泡分选决定簇(VSD))；质体，其包含叶绿体、有色体或白色体-运输肽(例如，能够与质体的类囊体膜相互作用的肽，诸如来自茄属(Solanum)的Rubisco的小子单元的叶绿体靶向信号)；或本领域技术人员已知的另一种运输肽；(iii)编码标签的多核苷酸序列，诸如聚组氨酸、瘦素、胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)、凝集素、麦芽糖结合蛋白(MBP)或谷胱甘肽S-转移酶(GST)或本领域的技术人员已知的其他标签；(iv)编码用于检测的标记物蛋白的多核苷酸序列，诸如黄色荧光蛋白(YPet)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶或本领域的技术人员已知的其他标记物蛋白；(v)编码蛋白酶裂解位点的多核苷酸序列，诸如肠激酶、凝乳酶或烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解位点中的一个或多个；或(vi)用于靶向质体诸如叶绿的psbA调节5′-UTR或3′UTR区体。还提供了用于在植物细胞或植物中表达蛋白的表达盒。表达盒包含本文所述的分离的多核苷酸。基于植物的表达盒可适用于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)-介导的转化。还提供了包含本文所述的分离的多核苷酸或基于植物的表达盒中任一个的植物细胞。植物细胞可以在悬浮培养物中的多个植物细胞中、在组织培养物中的植物细胞中、在植物或转基因植物的叶片中或其任何部分中的植物细胞中。植物细胞可来自单子叶植物或双子叶植物。在一些实施方案中，植物是烟草(Nicotianatobacum)植物。还提供了包含本文所述的分离的多核苷酸或基于植物的表达盒中任一个的植物子代或种子。本文还提供了通过将本文所述的分离的多核苷酸引入植物细胞并且在植物细胞中表达靶蛋白的一种在植物细胞中表达靶蛋白的方法。所述方法还可包括使植物细胞暴露于一种或多种诱导刺激的步骤。例如，这种诱导刺激可以是不同强度和周期的光暴露、冷休克、热休克、干旱条件诱导或激素诱导(诸如由于脱落酸(ABA))中的任一个或多个。“分离”的多核苷酸意指从其天然环境合成或分离并且以足以允许其鉴别或使用的量存在的多核苷酸。分离的多核苷酸可以是(i)体外通过例如聚合酶链反应(PCR)扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)如通过裂解和凝胶分离纯化；或(iv)通过例如化学合成的一种多核苷酸。分离的多核苷酸是可通过本领域熟知的重组DNA技术容易地操纵的一种多核苷酸。因此，被包含在其中5'和3'限制性位点是已知的或其中聚合酶链反应(PCR)引物序列已被公开的载体中的核苷酸序列被认为是分离的，但以其原生状态存在于其天然宿主中的核苷酸序列不是。分离的多核苷酸可以基本上被纯化，但不是必需的。在本专利技术的上下文中，多核苷酸与术语“核酸”可互换使用。如本文所用，“调节核酸序列”是指通常但不总是位于编码序列的上游(5')，并且通过提供对RNA聚合酶和/或在具体位点开始转录所需的其他因子的识别控制编码序列的表达的DNA序列。调节核酸序列的示例是启动子。启动子包含负责启动转录的核心启动子元件以及修饰基因表达的其他调节元件。应当理解，位于编码序列的内含子或3'内的核苷酸序列也可有助于调节编码序列的表达。本文所用的术语“功能等价片段”是指在调节可操作地连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，其包含调节核酸序列，所述调节核酸序列(a)与SEQ ID NO:1、3、4或18中任一个示出的多核苷酸序列或其功能等价片段具有至少95％或更多的序列同一性，或(b)在严格条件下与SEQ ID NO:1、3、4或18中任一个示出的多核苷酸序列的互补序列杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.18 US 14/575,479;2014.05.19 ZA 2014/036061.一种分离的多核苷酸，其包含调节核酸序列，所述调节核酸序列(a)与SEQIDNO:1、3、4或18中任一个示出的多核苷酸序列或其功能等价片段具有至少95％或更多的序列同一性，或(b)在严格条件下与SEQIDNO:1、3、4或18中任一个示出的多核苷酸序列的互补序列杂交。2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其还包含一个或多个限制酶位点以用于将与所述调节核酸序列异源的第二核酸序列插入所述多核苷酸，使得所述插入的第二核酸序列将可以可操作地连接到所述调节核酸序列，其中所述调节核酸序列能够指导所述第二可操作地连接的核酸序列的转录。3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其包含所述第二核酸序列，其中所述第二核酸序列编码与所述调节核酸序列异源的靶蛋白并且可操作地连接到所述调节核酸序列。4.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述调节核酸序列与SEQIDNO:1、3、4或18中任一个或其功能等价片段具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。5.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述调节核酸序列或其功能等价片段含有选自由以下组成的组的任一个或多个基序：SORLREP2AT、ASF1MOTIFCAMV、AS1CAMV、ATRICHPSPETE、GT1MOTIFPSRBCS、INRNTPSADB、CTRMCAMV35S、-10PEHVPSBD、LTREATLTI78、CBFHV、DRECRTCOREAT、LTRECOREATCOR15、MYCCONSENSUSAT、LRENPCABE、SORLIP1AT、BOXIIPCCHS、CCA1ATLHCB1、CGF1ATCAB2、GT1CONSENSUS、IBOXCORE、RBCSCONSENSUS、CIACADIANLELHC、GATABOX、SORLIP5AT以及CACTFTPPCA1。6.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中所述第二核苷酸序列编码可用于食品或饮料工业、制药工业、农业或化学工业的靶蛋白。7.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中所述第二核苷酸序列编码治疗性蛋白。8.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中所述第二核苷酸序列编码以下的一种或多种拷贝：(A)肺表面活性蛋白-B(SP-B)前蛋白原或其功能片段或类似物；(B)SP-B成熟肽或其功能片段或类似物；或(C)(A)和(B)两者。9.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其还包含编码选自由以下组成的组的信号肽的多核苷酸序列：equistatin和烟草硫堇(NtSP)的信号肽区。10.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其还包含编码选自由以下组成的组的运输肽的多核苷酸序列：内质网(ER)-运输肽；油体-运输肽、蛋白贮藏液泡-运输肽；以及质体-运输肽。11.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其还包含编码选自由以下组成的组的标签的多核苷酸序列：聚组氨酸、...

【专利技术属性】
技术研发人员：雅克布斯·彼得勒斯·齐威格勒，莫里茨·文特尔，
申请(专利权)人：阿扎根生物技术控股有限公司，
类型：发明
国别省市：南非,ZA