一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其包括：S1：靶序列退火复性；S2：PSG载体的酶切；S3：连接和转化；S4：重组质粒的鉴定和提取；S5：重组资料和PCC质粒的双酶切；S6：连接、转化和鉴定。其获得的载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点。

【技术实现步骤摘要】
一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法
本专利技术涉及植物分子生物学领域，尤其涉及应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法。
技术介绍
CRISPR/Cas9技术是自2013年兴起的一种高效简便的基因组编辑技术，目前已在动物、模式植物中得到广泛应用。它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，由于其可用于对DNA进行定点编辑，并且可以同时作用于多个靶位点，同时编辑多个基因，较常规转基因方法具有明显优势，且沉默效果更加彻底，因此越来越多的研究人员对其产生了浓厚兴趣。此外，在常用的基因组编辑技术中，CRISPR/Cas9相对于ZFN和TALEN技术，具有操作简便、制备成本低的巨大优势，使其在常规分子生物学实验室即可使用。目前，应用于动物上的CRISPR/Cas9载体已经有大量的报道，而应用于植物上的CRISPR/Cas9载体则相对较少，特别是能够进行多位点编辑的载体。
技术实现思路
为克服现有技术存在的上述技术问题，本专利技术提供了能够应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，由其获得的载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点。本专利技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括：S1：靶序列退火复性：根据选定的靶序列，合成互补的Oligo DNA，将合成的Oligo DNA序列进行退火复性获得DNA双链序列，并稀释；S2：PSG载体的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；S3：连接和转化：配置连接体系，将S1获得的稀释后的DNA双链序列与S2获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中；S4：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中震荡培养，分别以M13fwd和Oligo‑R为引物进行菌液P...

【技术特征摘要】
1.一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括：S1：靶序列退火复性：根据选定的靶序列，合成互补的OligoDNA，将合成的OligoDNA序列进行退火复性获得DNA双链序列，并稀释；S2：PSG载体的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；S3：连接和转化：配置连接体系，将S1获得的稀释后的DNA双链序列与S2获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中；S4：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中震荡培养，分别以M13fwd和Oligo-R为引物进行菌液PCR鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒；S5：重组资料和PCC质粒的双酶切：将得到的重组质粒和PCC质粒进行双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段；S6：连接、转化和鉴定：配置连接体系，将S5获得的酶切回收目标片段进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中，挑单菌落于LB/Kan液体培养基中震荡培养，并进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养，提取质粒，即获得构建好的CRISPR/Cas9载体。2.根据权利要求1所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述PSG载体的构建包括：以pX330质粒为模板，使用高保真酶PrimeSTARHSDNAPolymerase扩增sgRNA片段，回收该片段，标记为sgRNA1，引物序列为SEQIDNO.1所示的Sg1-F和SEQIDNO.2所示的Sg1-R；使用EcoRI-HF和XbaI分别双酶切pUC19和sgRNA1，回收目的片段后按1：7的摩尔比进行连接，得到重组质粒pSG1，测序，保留序列完全正确的阳性质粒；以pSG1质粒为模板，使用高保真酶PrimeSTARHSDNAPolymerase扩增sgRNA片段，回收该片段，标记为sgRNA，引物序列为SEQIDNO.3所示的Sg2-F和SEQIDNO.4所示的Sg2-R；使用EcoRI-HF和XbaI双酶切pUC19，使用BsaI酶切sgRNA，回收目的片段后按1：7的摩尔比进行连接，得到重组质粒pSG，测序，保留序列完全正确的阳性质粒。3.根据权利要求2所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述PCC载体的构建包括：以pX330质粒为模板，使用高保真酶PrimeSTARHSDNAPolymerase扩增hSpCas9片段，其中引物Cas-F：Cas-R1：Cas-R2＝1.5：0.2：1.3，回收该片段，标记为hSpCas9，Cas-F的序列如SEQIDNO.5所示，Cas-R1的序列如SEQIDNO.6所示，Cas-R2的序列如SEQIDNO.7所示；使用NcoI-HF和BstEII-HF分别双酶切pCAMBIA1302和hSpCas9，回收目的片段后按1：...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤浩茹，江雷雨，陈清，陈品文，冯琛，叶云天，李亚丽，张云婷，肖婕，王小蓉，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51