本发明专利技术包括材料和方法，用于从一个多核苷酸构建体(合成基因)产生许多小RNA来促进RNA‑引导的多元基因组编辑、修饰、表达抑制以及其他基于RNA的技术。所述合成基因/多核苷酸构建体编码由tRNA所分开的多顺反子RNA组件，并且优选还包括调节组件如启动子或终止子，以形成表达盒。一旦在细胞中经转录，转录物经内源tRNA加工系统而被细胞加工成多个RNA分子。所述系统可用于任何基于RNA的基因操纵方法，包括RNA‑介导的基因组编辑、人工微RNA介导的基因沉默、小RNA介导的遗传操纵、双链RNA介导的基因沉默、反义机制等等。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多元RNA引导的基因组编辑和其它RNA技术的方法和组合物专利
本专利技术涉及在分子生物学和遗传工程领域内用于基因靶向和基因组编辑的方法。更具体地，本专利技术描述了使用tRNA加工系统来使得能够进行基于多元RNA的或多元RNA引导的基因组工程、基因抑制等。专利技术背景用于特异性基因靶向或精准基因组编辑的方法学对于植物或动物基因的功能性表征而言是非常重要的。近年来，已经开发了序列特异性核酸酶来提高基因靶向或基因组编辑在植物、动物或微生物体系中的效率。近来，基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-相关核酸酶系统，已经在微生物和哺乳动物体系中开发了新的基因组编辑工具。所述CRISPR-相关核酸酶是细菌和古细菌获得性免疫的一部分。Cas9内切核酸酶，酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)II型CRISPR/Cas系统的成分，与称为CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(transcrRNA)的两个短RNA分子形成复合物，所述RNA分子引导核酸酶在特异性位点对非自身DNA的两条链进行切割。所述crRNA-transcrRNA异源双链体可以由一个嵌合RNA(所谓的引导RNA(gRNA))来取代，其继而可以被编排至靶向的特定位点。编排gRNA-Cas9的最小限制为经改造的5’-RNA和靶向的DNA之间至少15个碱基配对且无错配，以及在靶向的DNA序列中跟随碱基配对区的NGG基序(所谓的前间区序列邻近基序或PAM)。一般而言，gRNA区的5’末端中的15-22nt是用于指导Cas9核酸酶来在特定位点产生DSB。CRISPR/Cas系统对于人类、小鼠、斑马鱼、酵母和细菌中的基因组编辑已经得到了证明。与重组分子(DNA、RNA或蛋白质)可以直接进行转化而用于Cas9-介导的基因组编辑的动物、酵母、或细菌细胞不同，重组质粒DNA由于细胞壁的存在通常是经过土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化、基因枪轰击、或原生质体转化而递送至植物细胞内的。因而，需要创建专用的分子工具和方法，以有利于用于植物和动物细胞中基因组编辑的质粒DNA的构建和递送以及Cas9和gRNA的有效表达。用于制备和使用CRISPR-Cas系统的组合物和方法在题目为“用于改变基因产物的表达的CRISPR-Cas系统和方法”的美国专利号No.8,697,359中有描述，其以整体援引加入本文。原则上，多元遗传操纵可以通过表达多个针对相应靶向位点的gRNA和Cas9(或Cas9衍生的效应物)来实现。然而，由于递送方法和目前gRNA表达装置的局限，在植物、动物、或微生物生物体中同时产生许多种gRNA依然是种挑战。本专利技术的目标是提供这样的策略，使用细胞的内源tRNA加工系统作为有效且精准的手段来从单一多核苷酸构建体/合成基因产生许多种gRNA，由此加强CRISPR/Cas9或其它用于基因组工程的RNA介导的遗传操纵工具的多元编辑能力。在另一方面，本专利技术涉及包含上文所述核酸的多核苷酸构建体、表达盒、载体或经修饰的受体细胞。本专利技术的另外的目标、特征或优势是提供这样的组合物和方法，其用于操纵多个靶基因，或者单一靶基因中的多个位置，其引入单一表达盒，所述表达盒包括在受体细胞中利用tRNA系统的序列。另外的目标、特征和优势会在本文所包含的公开内容的基础上显而易见。专利技术概述申请人已经产生了材料和方法来从一个多核苷酸构建体(合成基因)产生许多小RNA，以促进RNA-引导的多元基因组编辑、表达抑制、遗传学或表观遗传学修饰、以及其它基于RNA的技术。所述合成基因/多核苷酸构建体编码由tRNA所分开的多顺反子RNA组件，并且优选还包括调节组件如启动子或终止子，以形成表达盒。一旦在细胞中经转录，转录物经内源tRNA加工系统而被细胞加工成多个RNA分子。本专利技术的方法可用于改良任何基于RNA的基因组编辑和调节技术，使得可以经单一的多核苷酸构建体和内源tRNA加工系统产生和分离出多元的RNA。此类方法可包括但不限于Cas9-介导的基因组编辑、人工微RNA介导的基因沉默、以及其它RNA-介导的机制等等。根据本专利技术，用于在受体细胞中产生多元RNA遗传操纵的方法包括，提供异源多核苷酸序列，其具有两个或更多个与一或多个tRNA切割序列(tRNA前体)串联的RNA介导的遗传操纵序列。该多核苷酸通过许多标准技术中任何技术来引入至受体细胞，并且经表达，所述受体细胞tRNA加工系统在tRNA序列处切割该异源多核苷酸。具体而言本专利技术提供了tRNA切割序列，其用于RNA-核酸裂解活性(如在tRNA前体剪接中)、3'末端mRNA前体内切核酸酶活性、tRNA前体切割活性、和/或核糖体RNA前体切割活性。所述RNA遗传操纵序列和所述RNA切割序列可操作地连接至用于在受体细胞中表达的调节序列，如启动子和终止子序列。tRNA切割序列包括与细胞的内源tRNA系统(如RNaseP、RNaseZ和RNaseE(细菌))有活性地相互作用(并被其切割)的任何序列和/或结构基序。这可包括结构识别元件如受体茎、D-环臂，TΨC环以及特定的序列基序。有许多tRNA活性序列和基序是本领域技术人员已知的并可用的，如通过tRNA-SE程序等资源，其可得自万维网lowelab.ucsc.edu/tRNAcan-SE/或万维网trna.bioinf.uni-leipzig.de/DataOutput/Organisms(对于所有生物体)，或万维网plantrna.ibmp.cnrs.fr/(对于植物)。许多文章和Genbank资源也是可用的并且在本文中引用。本专利技术还包括用于多元RNA遗传操纵的多核苷酸构建体、表达构建体、载体和受体细胞(已经过操纵)。所述构建体包含多核苷酸序列，其编码两个或更多个RNA介导的遗传操纵序列，所述RNA介导的遗传操纵序列与编码tRNA切割序列的序列串联。在一个实施方案中，该RNA介导的遗传操纵序列包括用于CAS9-介导的基因组编辑的引导RNA。该引导RNA(或gRNA)与内切核酸酶一起引入，在此情形中是CRISPR相关(Cas)核酸酶Cas9。该引导RNA提供支架(scaffold)和与靶点位互补的间隔区(spacer)序列。在另一实施方案中该RNA遗传操纵序列是干扰RNA如siRNA，或根据本领域中的标准方法设计为用于基因沉默的微RNA序列。该构建体还包括一或多个tRNA切割序列，其可以由细胞内的内源tRNA切割系统进行有活性地加工。所述构建体优选是表达构建体或合成基因(其包括启动子和终止子序列)。出乎意料地，申请人已发现当与CRISPR系统使用时，RNA切割组件提供多达30倍的更高的表达(很可能是由于内部tRNA启动子元件)。本专利技术还包括已经过遗传操纵的细胞及其后代，此类细胞可包括基因组插入或缺失或者通过基因沉默对基因表达的操纵。此类细胞的后代可以用于开发株系，以及植物和动物育种材料。在一些实施方案中所述细胞是人类细胞。虽然公开了多个实施方案，本领域技术人员从下文的详述(显示和描述了本专利技术说明性的实施方案)还可以了解本专利技术其它的实施方案。因此，附图和详述应视为说明性质的而不是限制性的。附图详述图1.改造内源tRNA系统用于由CRISPR/Cas9进行的多元基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于在受体细胞中产生多元RNA介导的遗传操纵的方法，其包括：获得多核苷酸构建体，其编码两个或更多个与一或多个tRNA切割序列串联排列的RNA介导的遗传操纵序列，和将所述构建体引入所述细胞，从而所述受体细胞的tRNA加工系统在所述tRNA序列处切割该异源多核苷酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.17 US 62/065,0931.用于在受体细胞中产生多元RNA介导的遗传操纵的方法，其包括：获得多核苷酸构建体，其编码两个或更多个与一或多个tRNA切割序列串联排列的RNA介导的遗传操纵序列，和将所述构建体引入所述细胞，从而所述受体细胞的tRNA加工系统在所述tRNA序列处切割该异源多核苷酸。2.权利要求1的方法，其中所述RNA介导的遗传操纵序列在所述受体细胞中靶向单一基因内的多个位点。3.权利要求1的方法，其中所述RNA介导的遗传操纵包括多个不同的基因。4.权利要求1的方法，其中所述RNA介导的遗传操纵是RNA引导的基因组编辑，其可包括靶向突变、依赖同源性的修复、转录激活和抑制、表观基因组编辑、和/或基因组标记。5.权利要求1的方法，其中所述RNA遗传操纵包括RNA干扰。6.权利要求6的方法，其中所述RNA干扰是微RNA和/或小RNA介导的RNA干扰。7.权利要求4的方法，其中所述RNA引导的基因组编辑包括CRISPRS。8.权利要求1的方法，其中所述tRNA切割序列包括pretRNA受体茎、D-环臂和TΨC-环臂。9.权利要求1的方法，其中所述tRNA切割序列包括用于RNaseP和/或RNaseZ和/或RNaseE中的一或多个的活性位点。10.权利要求1的方法，其中所述tRNA切割序列是SEQIDNO:13、188或189。11.权利要求1的方法，其中所述异源多核苷酸序列包括串联排列的tRNA-引导RNA。12.权利要求13的方法，其中所述引导RNA包括间隔区RNA和支架RNA序列。13.权利要求14的方法，其中所述异源多核苷酸序列包括tRNA-引导RNA-tRNA。14.权利要求1的方法，其中所述受体细胞是植物细胞。15.权利要求1的方法，其中所述受体细胞是动物细胞。16.权利要求1的方法，其中所述细胞是微生物细胞。17.权利要求1的方法，其中所述细胞是人类细胞。18.用于多元RNA介导的基因组操纵的核酸构建体，其包含：两个或更多个RNA介导的遗传操纵序列和tRNA切割序列。19.权利要求18的核酸构建体，其中所述两个或更多个RNA介导的遗传操纵序列在所述受体细胞中靶向单一基因内的多个位点。20.权利要求18的核酸构建体，其中所述RNA介导的遗传操纵序列靶向多个不同的基因或DNA元件。21.权利要求18的核酸构建体，其中所述RNA介导的遗传操纵序列是干扰RNA序列。22.权利要求21的核酸构建体，其中所述RNA干扰序列是微RNA和/或...
【专利技术属性】
技术研发人员：Y·杨，K·谢，
申请(专利权)人：宾州研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国,US
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