一个携带有NtRBSC1基因的瞬时表达载体制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一个携带有烟草核酮糖‑1,5‑二磷酸羧化酶的小亚基基因的重组瞬时表达载体。本发明专利技术利用烟草NtRBSC1基因构建了一个瞬时表达载体NtRBSC1‑pFF19‑GFP，该载体转化烟草细胞后，可使荧光标记基因GFP与NtRBSC1的融合蛋白能够在烟草原生质体，进而通过激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的位置而对NtRBSC1蛋白进行亚细胞定位，并对叶绿体的位置进行显示。总体而言，这种方式是一种简便而又准确的在活细胞中进行定位的方法，可为研究烟草细胞叶绿体及相关基因提供确切参考依据，便于烟草NtRBSC1基因的进一步研究及其功能的深入开发。

【技术实现步骤摘要】
一个携带有NtRBSC1基因的瞬时表达载体
本专利技术属于生物
，具体涉及一个携带有一个核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基基因（NtRBSC1）基因的重组瞬时表达载体。
技术介绍
叶绿体是植物细胞中，由双层膜围成、含有叶绿素、能进行光合作用的细胞器。叶绿体基质中悬浮有由膜囊构成的类囊体，内含叶绿体DNA，是一种质体，有圆形、卵圆形或盘形3种形态。叶绿体含有的叶绿素a、b吸收绿光最少，绿光被反射，故叶片呈绿色。叶绿体扁球状，厚约2.5微米，直径约5微米，具双层膜，内有间质，间质中含呈溶解状态的酶和片层。片层由闭合的中空盘状的类囊体垛堆而成，类囊体是形成高能化合物三磷酸腺苷(ATP)所必需，是植物的“养料制造车间”和“能量转换站”。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Ribulosebisphosphatecarboxylase/oxygenase），通常简写为RuBisCO，是一种酶(EC4.1.1.39)，分子量约为53kD，由8个大亚基和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，也是植物叶绿体的标志酶。它在光合作用的卡尔文循环中催化第一个主要的碳固定反应，将大气中游离的二氧化碳转化为生物体内储能分子，比如蔗糖分子。针对该酶，现有技术中仍然主要集中于该酶编码基因的克隆、分析等基础性工作，而对该酶的在细胞中的具体定位及其作用机理等情况的研究仍然相对缺乏。
技术实现思路
本专利技术主要是利用烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因（Ntab0062040，NtRBSC1）构建了瞬时表达载体，利用该表达载体，可更好地研究烟草NtRBSC1基因在烟草中的作用机理和作为烟草叶绿体的标志基因，从而进行叶绿体共定位研究。本申请所采取的技术方案详述如下。一个携带有NtRBSC1基因的瞬时表达载体，该载体携带有NtRBSC1（Ntab0062040）和一个荧光标记蛋白GFP的基因（以荧光标记蛋白GFP基因作为报告基因），其制备方法包括如下步骤：（1）PCR扩增，获得烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因NtRBSC1，具体为：以红花大金元烟草品种为材料，提取其总RNA，并进一步反转录得cDNA，以此为模板，设计NtRBSC1-F/NtRBSC1-R引物对，进行PCR扩增，获得NtRBSC1的扩增产物，并对扩增产物进行回收；所述NtRBSC1-F/NtRBSC1-R引物对，具体序列为：NtRBSC1-F:CGGGGTACCATGTCTGTCTCAAGTT，其中GGTACC部分序列为KpnI酶切位点，NtRBSC1-R:CGCGGATCCAGATGCTACAGG，其中GGATCC部分序列为BamHI酶切位点；所述NtRBSC1基因，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；（2）酶切，并连接，具体为：对步骤（1）中回收所获得的NtRBSC1的扩增产物，采用KpnI和BamHI进行双酶切处理，并回收酶切产物；同时对pFF19-GFP载体，同样采用KpnI和BamHI进行双酶切处理，并回收酶切产物；50μL双酶切体系设计参考如下：BufferK，2.5μL；BamHI，2.5μL；SphI，2.5μL；步骤（1）中的NtRBSC1的扩增产物（或pFF19-GFP载体），20μL；灭菌水加至50μL；采用T4DNA连接酶将上述NtRBSC1的酶切产物的粘性末端与pFF19-GFP载体的双酶切产物的粘性末端进行连接，10μL连接体系参考设置如下：NtRBSC1酶切产物，1μL；pFF19-GFP载体酶切产物，1μL；T4DNA连接酶，1μL；ddH2O加至10μL；16℃连接过夜；（3）转化，筛选，具体为：将步骤（2）中的连接产物转化转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行抗性筛选，并挑取阳性菌落进行测序验证，对于验证正确的菌株进行扩大培养，并提取质粒备用；此质粒即为含有烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因NtRBSC1和荧光标记蛋白GFP基因的瞬时表达载体，将此质粒载体命名为NtRBSC1-pFF19-GFP。所述携带有NtRBSC1基因的瞬时表达载体在烟草中的应用，将NtRBSC1-pFF19-GFP质粒载体通过基因枪介导转化法转化烟草细胞悬浮液（如BY-2烟草细胞悬浮），或者通过PEG介导的原生质体转化法转化烟草原生质体，转化后室温暗培养8~16h，通过激光共聚焦显微镜观察悬浮细胞或原生质体，基因表达后，该基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白定于植物的叶绿体，该载体可以作为烟草叶绿体的共定位表达载体；换言之，通过融合蛋白在细胞中的荧光显示位置即可定位烟草NtRBSC1，从而便于烟草叶绿体的定位和其作用机理的研究。前期工作基础上，专利技术人克隆到了一个核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基基因（内部编号Ntab0062040），将之命名为NtRBCS1。为进一步研究该基因的功能，专利技术人利用此NtRBSC1基因构建了一个瞬时表达载体NtRBSC1-pFF19-GFP，该载体转化烟草细胞后，可使荧光标记蛋白GFP与NtRBSC1蛋白能够在悬浮细胞中共表达（即，对NtRBSC1进行了荧光标记），进而通过激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的位置而对NtRBSC1蛋白进行亚细胞定位。总体而言，这种方式是一种简便而又准确的在活细胞中进行定位的方法，可为研究烟草细胞叶绿体及相关基因提供确切参考依据，便于烟草NtRBSC1基因的进一步研究及其功能的深入开发。附图说明图1为所构建瞬时表达载体NtRBSC1-pFF19-GFP的酶切验证图，其中M为DL2000DNAmarker，1为NtRBSC1-pFF19-GFP质粒酶切图；图2为所构建瞬时表达载体NtRBSC1-pFF19-GFP转化烟草细胞后激光共聚焦显微图，从图中荧光位置可对烟草NtRBSC1进行定位；图中“Tag”为荧光标签通道，“Chi”为叶绿素通道，“DIC”为明场通道，“Merge”为通道叠加。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂及实验设备，简要介绍说明如下。生物材料：烟草红花大金元，购自于云南省烟草农业科学研究院中国烟草育种研究南方中心；实验过程中，栽培于中国烟草总公司郑州烟草研究院基因中心光照培养间内，制备RNA样品时，取大十字期的烟草幼嫩叶片进行相关操作；引物合成及测序公司均有生工生物工程（上海）股份有限公司完成；pFF19-GFP载体，均为现有生物材料或按现有技术制备即可；实验试剂：PCR反应试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品；反转录试剂盒，SMARTMMLV反转录酶、KpnI、BamHI酶、T4DNA连接酶（SolutionI连接酶）等，均为TaKaRa生物技术有限公司产品；实验设备：激光共聚焦显微镜，德国LeicaSP5STEDCW。实施例1本申请所提供的携带有NtRBSC1基因的瞬时表达载体，该载体携带有NtRBSC1（Ntab0062040））和一个荧光标记蛋白GFP的基因（以荧光标记蛋白GFP基因作为报告基因），其制备方法详述如下。（1）PCR扩增，获得NtRBSC1基因，具体为：以红花大金元烟草品种为材料，提取其总RNA（RIN≥7.5），并进一步反转录得cDNA，以此为模板，设计N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个携带有NtRBSC1基因的瞬时表达载体，其特征在于，该载体携带有烟草核酮糖‑1,5‑二磷酸羧化酶的小亚基基因NtRBSC1和一个荧光标记蛋白GFP的基因，通过如下步骤制备而成：（1）PCR扩增，获得烟草核酮糖‑1,5‑二磷酸羧化酶的小亚基基因NtRBSC1，具体为：提取烟草材料总RNA，反转录得cDNA，以此为模板，设计NtRBSC1‑F/NtRBSC1‑R引物对，进行PCR 扩增，获得烟草核酮糖‑1,5‑二磷酸羧化酶的小亚基基因NtRBSC1的扩增产物，并对扩增产物进行回收；所述NtRBSC1‑F/NtRBSC1‑R引物对，具体序列为：NtRBSC1‑F: CGGGGTACCATGTCTGTCTCAAGTT，NtRBSC1‑R: CGCGGATCCAGATGCTACAGG；所述NtRBSC1基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；（2）酶切，并连接，具体为：对步骤（1）中回收所获得的基因NtRBSC1的扩增产物，采用KpnI和BamHI进行双酶切处理，并回收酶切产物；同时对pFF19‑GFP载体，同样采用KpnI和BamHI进行双酶切处理，并回收酶切产物；采用T4 DNA连接酶将上述烟草核酮糖‑1,5‑二磷酸羧化酶的小亚基基因NtRBSC1的酶切产物的粘性末端与pFF19‑GFP载体的双酶切产物的粘性末端进行连接；（3）转化，筛选，具体为：将步骤（2）中的连接产物转化转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行抗性筛选，并挑取阳性菌落验证，对于验证正确的菌株进行扩大培养，并提取质粒，此质粒载体为瞬时表达载体NtRBSC1‑pFF19‑GFP。...

【技术特征摘要】
1.一个携带有NtRBSC1基因的瞬时表达载体，其特征在于，该载体携带有烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基基因NtRBSC1和一个荧光标记蛋白GFP的基因，通过如下步骤制备而成：（1）PCR扩增，获得烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基基因NtRBSC1，具体为：提取烟草材料总RNA，反转录得cDNA，以此为模板，设计NtRBSC1-F/NtRBSC1-R引物对，进行PCR扩增，获得烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基基因NtRBSC1的扩增产物，并对扩增产物进行回收；所述NtRBSC1-F/NtRBSC1-R引物对，具体序列为：NtRBSC1-F:CGGGGTACCATGTCTGTCTCAAGTT，NtRBSC1-R:CGCGGATCCAGATGCTACAGG；所述NtRBSC1基因，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；（2）酶切，并连接，具体为：对步骤（1）中回收所获得的基因NtRBSC1的扩增产物，采用KpnI和BamHI进行双酶切处理，并回收酶切产物；同时对pFF19-GFP载体，同样采用KpnI和BamHI进行双酶切处理，并回收酶切产物；采用T4D...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈千思，周会娜，刘萍萍，王燃，陈霞，翟妞，李锋，武明珠，金立锋，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41