改变多肽表达的方法技术
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改变多肽表达的方法本申请要求2014年5月30日提交的美国临时申请第62/005,571号和2014年9月3日提交的美国临时申请第62/045,507号的权益和优先权，所述美国临时申请中的每一者以引用的方式并入本文中。本专利公开内容含有受版权保护的材料。版权所有者不反对任何人传真复制所述专利文件或专利公开内容在美国专利与商标局的专利文件或记录中出现的内容，但其它方面保留任何和所有版权。本文中引用的全部专利、专利申请和公开都以全文引用的方式并入本文中。以其全文引用的这些公开的公开内容特此以引用的方式并入本申请中，以便较充分地描述截至本文所描述专利技术的如本领域技术人员所已知的现有技术水平。
技术介绍
重组多肽的过度表达是当代生物化学、结构生物学和生物技术中的中心方法。许多重组多肽在表达系统中产生时以低水平表达或根本不表达。工业应用(如药物发现和疫苗制备)经常需要制备大量的多肽。许多类型的表达系统可以用以合成蛋白质，包括哺乳动物、真菌和细菌表达系统。然而，目标重组多肽的过度表达可能成问题，其中低表达量由不良转录和翻译产生。重组多肽表达的这种固有限制给此类系统的使用带来了一个...
【技术保护点】
一种通过引入一个或多个同义取代增加重组多肽在表达系统中表达的方法，所述方法包含提供包含编码所述多肽的编码序列和包含核糖体结合位点的5'UTR的核酸序列，并且其中所述5'UTR功能性地连接到所述编码序列，以及(a)在所述5'UTR中引入一个或多个取代或在基本上由所述编码序列的前48个核酸组成的头序列中引入一个或多个同义核酸取代，其中所述5'UTR中的所述一个或多个取代和所述一个或多个同义核酸取代增加对应于所述头序列和功能性地连接到所述编码序列的所述5'UTR的RNA序列的预测折叠自由能；(b)在基本上由所述头序列下游的编码序列组成的尾序列中引入一个或多个同义核酸取代，其中所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.30 US 62/005,571;2014.09.03 US 62/045,5071.一种通过引入一个或多个同义取代增加重组多肽在表达系统中表达的方法，所述方法包含提供包含编码所述多肽的编码序列和包含核糖体结合位点的5'UTR的核酸序列，并且其中所述5'UTR功能性地连接到所述编码序列，以及(a)在所述5'UTR中引入一个或多个取代或在基本上由所述编码序列的前48个核酸组成的头序列中引入一个或多个同义核酸取代，其中所述5'UTR中的所述一个或多个取代和所述一个或多个同义核酸取代增加对应于所述头序列和功能性地连接到所述编码序列的所述5'UTR的RNA序列的预测折叠自由能；(b)在基本上由所述头序列下游的编码序列组成的尾序列中引入一个或多个同义核酸取代，其中所述一个或多个同义核酸取代改变对应于所述尾序列内的一个或多个尾序列窗中的每一者的RNA序列的预测折叠自由能，使其在约(-0.32*(W-18))kcal/mol减10kcal/mol或加5kcal/mol范围内，其中W是所述尾序列窗中的核苷酸数目；(c)在所述头序列的前18个核酸中引入一个或多个同义核酸取代，以便在可能时用具有更低鸟嘌呤含量或更高腺嘌呤含量的同义密码子置换密码子2、3、4、5和6中的每一者；(d)根据选自以下任一者的子方法优化所述编码序列中的密码子：6AA方法、31C-FO方法、模型M(ModelM)方法、CHGlir方法或BLOGIT方法；(e)在所述编码序列中引入一个或多个取代，以便置换由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个间插密码子间隔开的相同重复密码子对，以便将所述重复密码子中的至少一者改变成不同同义密码子；(f)取代所述编码序列内的ATAATA双密码子重复序列中的至少一个核酸，以便引入不是ATAATA序列的同义双密码子重复序列；和(g)用以A或T结束的同义密码子取代所述编码序列中的至少一个以G或C结束的密码子。2.一种通过引入一个或多个同义取代增加重组多肽在表达系统中表达的方法，所述方法包含提供包含编码所述多肽的编码序列和包含核糖体结合位点的5'UTR的核酸序列，并且其中所述5'UTR功能性地连接到所述编码序列，并且进一步包含以下中的一者或多者：(a)在所述5'UTR中引入一个或多个取代或在基本上由所述编码序列的前48个核酸组成的头序列中引入一个或多个同义核酸取代，其中所述5'UTR中的所述一个或多个取代和所述一个或多个同义核酸取代增加对应于所述头序列和功能性地连接到所述编码序列的所述5'UTR的RNA序列的预测折叠自由能,(b)在基本上由所述头序列下游的编码序列组成的尾序列中引入一个或多个同义核酸取代，其中所述一个或多个同义核酸取代改变对应于所述尾序列内的一个或多个尾序列窗中的每一者的RNA序列的预测折叠自由能，使其在约(-0.32*(W-18))kcal/mol减10kcal/mol或加5kcal/mol范围内，其中W是所述尾序列窗中的核苷酸数目；(c)在所述头序列的前18个核酸中引入一个或多个同义核酸取代，以便在可能时用具有更低鸟嘌呤含量或更高腺嘌呤含量的同义密码子置换密码子2、3、4、5和6中的每一者；(d)根据选自以下任一者的子方法优化所述编码序列中的密码子：6AA方法、31C-FO方法、模型M方法、CHGlir方法或BLOGIT方法；(e)在所述编码序列中引入一个或多个取代，以便置换由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个间插密码子间隔开的相同重复密码子对，以便将所述重复密码子中的至少一者改变成不同同义密码子；(f)取代所述编码序列内的ATAATA双密码子重复序列中的至少一个核酸，以便引入不是ATAATA序列的同义双密码子重复序列；和(g)用以A或T结束的同义密码子取代所述编码序列中的至少一个以G或C结束的密码子。3.一种通过引入一个或多个同义取代增加重组多肽在表达系统中表达的方法，所述方法包含提供包含编码所述多肽的编码序列的核酸序列，以及(a)在基本上由所述编码序列的前48个核酸组成的头序列中引入一个或多个取代，其中所述一个或多个同义核酸取代增加对应于所述头序列的RNA序列的预测折叠自由能；(b)在基本上由所述头序列下游的编码序列组成的尾序列中引入一个或多个同义核酸取代，其中所述一个或多个同义核酸取代改变对应于所述尾序列内的一个或多个尾序列窗中的每一者的RNA序列的预测折叠自由能，使其在约(-0.32*(W-18))kcal/mol减10kcal/mol或加5kcal/mol范围内，其中W是所述尾序列窗中的核苷酸数目；(c)在所述头序列的前18个核酸中引入一个或多个同义核酸取代，以便在可能时用具有更低鸟嘌呤含量或更高腺嘌呤含量的同义密码子置换密码子2、3、4、5和6中的每一者；(d)根据选自以下任一者的子方法优化所述编码序列中的密码子：6AA方法、31C-FO方法、模型M方法、CHGlir方法或BLOGIT方法；(e)在所述编码序列中引入一个或多个取代，以便置换由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个间插密码子间隔开的相同重复密码子对，以便将所述重复密码子中的至少一者改变成不同同义密码子；(f)取代所述编码序列内的ATAATA双密码子重复序列中的至少一个核酸，以便引入不是ATAATA序列的同义双密码子重复序列；和(g)用以A或T结束的同义密码子取代所述编码序列中的至少一个以G或C结束的密码子。4.一种通过引入一个或多个同义取代增加重组多肽在表达系统中表达的方法，所述方法包含提供包含编码所述多肽的编码序列的核酸序列，并且进一步包含以下中的一者或多者：(a)在基本上由所述编码序列的前48个核酸组成的头序列中引入一个或多个取代，其中所述一个或多个同义核酸取代增加对应于所述头序列的RNA序列的预测折叠自由能；(b)在基本上由所述头序列下游的编码序列组成的尾序列中引入一个或多个同义核酸取代，其中所述一个或多个同义核酸取代改变对应于所述尾序列内的一个或多个尾序列窗中的每一者的RNA序列的预测折叠自由能，使其在约(-0.32*(W-18))kcal/mol减10kcal/mol或加5kcal/mol范围内，其中W是所述尾序列窗中的核苷酸数目；(c)在所述头序列的前18个核酸中引入一个或多个同义核酸取代，以便在可能时用具有更低鸟嘌呤含量或更高腺嘌呤含量的同义密码子置换密码子2、3、4、5和6中的每一者；(d)根据选自以下任一者的子方法优化所述编码序列中的密码子：6AA方法、31C-FO方法、模型M方法、CHGlir方法或BLOGIT方法；(e)在所述编码序列中引入一个或多个取代，以便置换由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个间插密码子间隔开的相同重复密码子对，以便将所述重复密码子中的至少一者改变成不同同义密码子；(f)取代所述编码序列内的ATAATA双密码子重复序列中的至少一个核酸，以便引入不是ATAATA序列的同义双密码子重复序列；和(g)用以A或T结束的同义密码子取代所述编码序列中的至少一个以G或C结束的密码子。5.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述方法由以下中任一者组成：步骤a；步骤b；步骤c；步骤；步骤d；步骤e；步骤f；步骤g；步骤ab；步骤ac；步骤ad；步骤ae；步骤af；步骤ag；步骤bc；步骤bd；步骤be；步骤bf；步骤bg；步骤cd；步骤ce；步骤cf；步骤cg；步骤de；步骤df；步骤dg；步骤ef；步骤eg；步骤fg；步骤abc；步骤abd；步骤abe；步骤abf；步骤abg；步骤acd；步骤ace；步骤acf；步骤acg；步骤ade；步骤adf；步骤adg；步骤aef；步骤aeg；步骤afg；步骤bcd；步骤bce；步骤bcf；步骤bcg；步骤bde；步骤bdf；步骤bdg；步骤bef；步骤beg；步骤bfg；步骤cde；步骤cdf；步骤cdg；步骤cef；步骤ceg；步骤cfg；步骤def；步骤deg；步骤dfg；步骤efg；步骤abcd；步骤abce；步骤abcf；步骤abcg；步骤abde；步骤abdf；步骤abdg；步骤abef；步骤abeg；步骤abfg；步骤acde；步骤acdf；步骤acdg；步骤acef；步骤aceg；步骤acfg；步骤adef；步骤adeg；步骤adfg；步骤aefg；步骤bcde；步骤bcdf；步骤bcdg；步骤bcef；步骤bceg；步骤bcfg；步骤bdef；步骤bdeg；步骤bdfg；步骤befg；步骤cdef；步骤cdeg；步骤cdfg；步骤cefg；步骤defg；步骤abcde；步骤abcdf；步骤abcdg；步骤abcef；步骤abceg；步骤abcfg；步骤abdef；步骤abdeg；步骤abdfg；步骤abefg；步骤acdef；步骤acdeg；步骤acdfg；步骤acefg；步骤adefg；步骤bcdef；步骤bcdeg；步骤bcdfg；步骤bcefg；步骤bdefg；步骤cdefg；步骤abcdef；步骤abcdeg；步骤abcdfg；步骤abcefg；步骤abdefg；步骤acdefg；步骤bcdefg；或步骤abcdefg。6.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述优化所述编码序列中的密码子包含(i)用具有更高CHGlir斜率的同义密码子取代所述头序列中的至少一个密码子；(ii)用具有更高CHGlir斜率的同义密码子取代所述头序列中的所有密码子；(iii)用具有更低CHGlir斜率的同义密码子取代所述头序列中的至少一个密码子并且用具有更高CHGlir斜率的同义密码子取代所述头序列中的至少一个密码子；(iv)用具有更高BLOGIT系数的同义密码子取代所述头序列中的至少一个密码子；(v)用具有更高BLOGIT系数的同义密码子取代所述头序列中的所有密码子；或(vi)用具有更低BLOGIT系数的同义密码子取代所述头序列中的至少一个密码子并且用具有更高BLOGIT系数的同义密码子取代所述头序列中的至少一个密码子；(vii)用具有更高CHGlir斜率的同义密码子取代所述尾序列中的至少一个密码子；(viii)用具有更高CHGlir斜率的同义密码子取代所述尾序列中的所有密码子；(ix)用具有更低CHGlir斜率的同义密码子取代所述尾序列中的至少一个密码子并且用具有更高CHGlir斜率的同义密码子取代所述尾序列中的至少一个密码子；(x)用具有更高BLOGIT系数的同义密码子取代所述尾序列中的至少一个密码子；(xi)用具有更高BLOGIT系数的同义密码子取代所述尾序列中的所有密码子；(xii)用具有更低BLOGIT系数的同义密码子取代所述尾序列中的至少一个密码子并且用具有更高BLOGIT系数的同义密码子取代所述尾序列中的至少一个密码子。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)的所述取代不改变所述5'UTR的所述核糖体结合位点。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核糖体结合位点是Kozak序列或夏因达尔加诺(ShineDalgarno)序列。9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述5'UTR进一步包含5'cap序列。10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(a)的所述取代不改变所述5'cap序列。11.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述取代不干扰对应于所述编码序列或所述5'UTR的所述RNA的功能加工。12.根据权利要求1到2中任一项所述的方法，其中步骤(a)包含将所述预测折叠自由能增加到至少约-35kcal/mol。13.根据权利要求1到2中任一项所述的方法，其中步骤(a)包含将预测折叠自由能增加到至少约-39kcal/mol。14.根据权利要求3或4所述的方法，其中步骤(a)包含将预测折叠自由能增加到至少约-5kcal/mol。15.根据权利要求3或4所述的方法，其中步骤(a)包含最大化预测折叠自由能。16.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中当所述尾序列窗在96个核酸中时，步骤(b)的预测折叠自由能在约-20kcal/mol到约-40kcal/mol范围内。17.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中预测折叠自由能用RNAstructure使用默认参数计算。18.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中预测折叠自由能用UNAFOLD、ViennaRNA、mFold、Sfold、Bindigo或Bindigonet使用默认参数计算。19.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(a)或步骤(b)的所述一个或多个同义核酸取代选自包含以下的清单：(i)用GCA密码子取代GCT密码子，或用GCT密码子取代GCA密码子；(ii)用CGA密码子取代CGT密码子，或用CGT密码子取代CGA密码子；(iii)用CAG密码子取代CAA密码子，或用CAA密码子取代CGA密码子；(iv)用CAC密码子取代CAT密码子，或用CAT密码子取代CAC密码子；(v)用ATC密码子取代ATT密码子，或用ATT密码子取代ATC密码子；(vii)将TTA密码子取代成TTG密码子或CTA密码子，或将TTG密码子取代成TTA密码子或CTA密码子，或将CTA密码子取代成TTA密码子或TTG密码子；(viii)用CCA密码子取代CCT密码子，或用CCT密码子取代CCA密码子；(ix)用TCA密码子取代AGT密码子，或用AGT密码子取代TCA密码子；和(x)用ACT密码子取代ACA密码子，或用ACA密码子取代ACT密码子；和(xi)用GTA密码子取代GTT密码子，或用GTT密码子取代GTA密码子。20.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述尾序列内的所述一个或多个尾序列窗是重叠序列窗。21.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述一个或多个重叠序列窗重叠25个核酸。22.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述尾序列内的所述一个或多个尾序列窗不重叠。23.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述尾序列内的所述一个或多个尾序列窗具有48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143或144个核酸的长度。24.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述尾序列内的所述一个或多个尾序列窗具有至少约145个核酸、至少约150个核酸、至少约160个核酸、至少约170个核酸、至少约180个核酸、至少约190个核酸、至少约200个核酸、至少约220个核酸、至少约240个核酸、至少约260个核酸、至少约280个核酸、至少约300个核酸、至少约340个核酸、至少约380个核酸、至少约420个核酸、至少约460个核酸、至少约500个核酸、至少约600个核酸、至少约700个核酸、至少约800个核酸、至少约900个核酸、至少约1000个或更多个核酸的长度。25.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述尾序列内的所述一个或多个尾序列窗具有47个或更少个核酸的长度。26.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述尾序列内的所述一个或多个尾序列窗具有145个或更多个核酸的长度。27.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述6AA方法包含：(i)将所述编码序列中编码精氨酸残基的所有密码子改变成CGT；(ii)将所述编码序列中编码天冬氨酸的所有密码子改变成GAT；(iii)将所述编码序列中编码谷氨酰胺的所有密码子改变成CAA；(iv)将所述编码序列中编码谷氨酸的所有密码子改变成GAA；(v)将所述编码序列中编码组氨酸残基的所有密码子改变成CAT；和(vi)将所述编码序列中编码异亮氨酸的所有密码子改变成ATT。28.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述6AA方法包含以下中任一者：(i)将所述编码序列中编码精氨酸残基的任何密码子中的至少一者改变成CGT；(ii)将所述编码序列中编码天冬氨酸的任何密码子中的至少一者改变成GAT；(iii)将所述编码序列中编码谷氨酰胺的任何密码子中的至少一者改变成CAA；(iv)将所述编码序列中编码谷氨酸的任何密码子中的至少一者改变成GAA；(v)将所述编码序列中编码组氨酸残基的任何密码子中的至少一者改变成CAT；或(vi)将所述编码序列中编码异亮氨酸的任何密码子中的至少一者改变成ATT。29.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述31C-FO方法包含用具有更高二元逻辑回归斜率的同义密码子取代至少一个密码子。30.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述31C-FO方法包含用具有更高二元逻辑回归斜率的同义密码子取代所有密码子。31.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述31C-FO方法包含用具有更低二元逻辑回归斜率的同义密码子取代至少一个密码子并且用具有更高二元逻辑回归斜率的同义密码子取代至少一个密码子。32.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述31C-FO方法包含用具有更高序数逻辑回归斜率的同义密码子取代至少一个密码子。33.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述31C-FO方法包含用具有更高序数逻辑回归斜率的同义密码子取代所有密码子。34.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述31C-FO方法包含用具有更低序数逻辑回归斜率的同义密码子取代至少一个密码子并且用具有更高序数逻辑回归斜率的同义密码子取代至少一个密码子。35.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述31C-FO方法包含以下中任一者：(i)将所述编码序列中编码丙氨酸的任何密码子中的至少一者改变成GCT或GCA；(ii)将所述编码序列中编码精氨酸的任何密码子中的至少一者改变成CGT或CGA；(iii)将所述编码序列中编码天冬酰胺的任何密码子中的至少一者改变成AAT；(iv)将所述编码序列中编码天冬氨酸的任何密码子中的至少一者改变成GAT；(v)将所述编码序列中编码半胱氨酸的任何密码子中的至少一者改变成TGT；(vi)将所述编码序列中编码谷氨酰胺的任何密码子中的至少一者改变成CAA或CAG；(vii)将所述编码序列中编码谷氨酸的任何密码子中的至少一者改变成GAA；(viii)将所述编码序列中编码甘氨酸的任何密码子中的至少一者改变成GGT；(ix)将所述编码序列中编码组氨酸的任何密码子中的至少一者改变成CAT或CAC；(x)将所述编码序列中编码异亮氨酸的任何密码子中的至少一者改变成ATT或ATC；(xi)将所述编码序列中编码亮氨酸的任何密码子中的至少一者改变成TTA、TTG或CTA中任一者；(xii)将所述编码序列中编码赖氨酸的任何密码子中的至少一者改变成AAA；(xiii)将所述编码序列中编码甲硫氨酸的任何密码子中的至少一者改变成ATG；(xiv)将所述编码序列中编码苯丙氨酸的任何密码子中的至少一者改变成TTT；(xv)将所述编码序列中编码脯氨酸的任何密码子中的至少一者改变成CCT或CCA；(xvi)将所述编码序列中编码丝氨酸的任何密码子中的至少一者改变成AGT或TCA；(xvii)将所述编码序列中编码苏氨酸的任何密码子中的至少一者改变成ACA或ACT；(xviii)将所述编码序列中编码色氨酸的任何密码子中的至少一者改变成TGG；(xix)将所述编码序列中编码酪氨酸的...
【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·法兰西斯·III·杭特，丹尼尔·奥尔贝茨，格雷戈里·P·鲍尔，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学理事会，约翰·法兰西斯·III·杭特，丹尼尔·奥尔贝茨，格雷戈里·P·鲍尔，
类型：发明
国别省市：美国,US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。