同种型特异性钙蛋白酶抑制剂及其识别方法和用途技术

本发明专利技术提出了选择性抑制或刺激钙蛋白酶同种型活性的分子。还提出了筛选和表征这些分子的方法。使用新型的钙蛋白酶抑制剂、底物和相关方法表征了钙蛋白酶‑1、钙蛋白酶‑2在长期增强(LTP)、学习和记忆力、神经退行性疾病和突触功能障碍疾病中的具体功能。预期本发明专利技术所述的化合物、组合物和方法可用于治疗神经退行性疾病和其他突触功能疾病，并用在有需要的患者中调节认知。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】同种型特异性钙蛋白酶抑制剂及其识别方法和用途相关申请的交叉引用本申请要求于2014年11月11日提交的美国专利申请序列No.62/078221的优先权，其公开的内容通过引用并入本申请。
本专利技术涉及抑制钙蛋白酶-1或钙蛋白酶-2功能的产品和识别产物的方法，以及特异性抑制钙蛋白酶-1或钙蛋白酶-2激活或活性或用于激活钙蛋白酶-1的方法，并涉及治疗和预防易受分子治疗的疾病的方法，该分子治疗干扰钙蛋白酶-1或钙蛋白酶-2的功能，或激活或增加钙蛋白酶-1的活性。
技术介绍
通用的钙蛋白酶抑制剂以及其治疗疾病的用途作为治疗剂并不成功(Donkor，2011，通过引用并入本文)。本专利技术中，提供了钙蛋白酶-2选择性抑制剂，或单独的钙蛋白酶-1抑制剂，或钙蛋白酶-2选择性抑制剂和/或钙蛋白酶-1激活剂的特殊用途的证据。文献描述了对一种钙蛋白酶而非另一种钙蛋白酶具有更高选择性的抑制剂的几个实例(Li等人，1996；Li等人，1993，均通过引用并入本文)，但是这些公开的内容承认并不知道钙蛋白酶-1或钙蛋白酶-2选择性抑制剂的用途，并且需要额外的实验来确定这些化合物是否具有治疗价值。实际上，尽管钙蛋白酶-1与钙蛋白酶-2之间缺少差异，本领域已经认识到开发钙蛋白酶选择性抑制剂的一般需要。虽然通用的钙蛋白酶抑制剂(其包括超过10种变体)已被成功用于动物模型中各种疾病的治疗，但是没有一种进展到临床试验，部分是由于缺乏选择性。因此，对更多的选择性钙蛋白酶抑制剂以及更好地了解钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2的功能，存在长期但不甚了解的需要。强调这样一个结论的证据是基于钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2分辨能力之间的一些其他区别。例如，钙蛋白酶-10基因(CAPN10)多态性与2型糖尿病(T2DM)相关；钙蛋白酶-1(μ-钙蛋白酶)、钙蛋白酶-2(m-钙蛋白酶)、钙蛋白酶-3和钙蛋白酶-5也与T2DM相关的代谢途径相联系(Donkor，2011)。在本公开之前，并未认识到钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2与LTP、学习和记忆力、神经退行性疾病、突触功能障碍疾病、细胞保护性信号级联(钙蛋白酶-1)和细胞死亡级联(钙蛋白酶-2)有差异地相联系。钙蛋白酶-1激活与突触NMDA受体刺激相联系，这说明了其在LTP诱导中的必要作用。它还参与由延长的突触NMDA受体刺激引起的神经保护作用(参见图1)。另一方面，钙蛋白酶-2与突触后NMDA受体刺激相联系，并参与神经退行性疾病(参见图1)。钙蛋白酶-2也被BDNF—>ERK介导的磷酸化激活，并限制θ节律刺激(TBS)后的LTP程度。因此，选择性钙蛋白酶-2抑制剂可以同时是神经保护和认知增强剂。相对于半胱氨酸蛋白酶如组织蛋白酶(Cuerrier等人，2007，通过引用并入本文)或其它蛋白酶(Sorimachi等人，2012，通过引用并入本文)，已经显著改善了钙蛋白酶的选择性。虽然文献已经描述了对钙蛋白酶-2而不是钙蛋白酶-1具有某种程度的选择性的抑制剂，反之亦然，但直到现在也没有创造出具有特定底物益处的抑制剂。钙蛋白酶抑制剂IV(羧基苄基-亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸-CH2-F)对钙蛋白酶-1显示出一些选择性，但是效果似乎随细胞类型变化(Powers等人，2002，通过引用并入本文)。尽管有助于PTEN特异性的结构元件的完全呈现可能难以在小分子中捕获，但是对于特异性的全面记录将为设计高度特异性的钙蛋白酶-2抑制剂提供坚实的结构基础。
技术实现思路
本专利技术描述了与同种型选择性钙蛋白酶抑制剂相关的组合物和方法。同种型选择性抑制剂作用于钙蛋白酶-1或钙蛋白酶-2，并因此与其中另一种相比选择性地降低其中一种同种型的活性。钙蛋白酶-1或钙蛋白酶-2的选择性抑制剂可以抑制催化活性，降低表达，选择性降解、抑制或加速化学修饰，或影响与钙蛋白酶-1或钙蛋白酶-2相互作用的一种或多种蛋白质之间的蛋白质相互作用。钙蛋白酶同种型的选择性抑制剂也可以与试剂结合，该试剂影响抑制剂的靶向、稳定性、迁移率、外显率、生物利用度或浓度。选择性钙蛋白酶抑制剂可以以多种不同的形式存在，包括核酸、肽、多肽、肽类似物、碳水化合物、脂质或其它有机或无机分子。根据本专利技术的钙蛋白酶-2的各种选择性抑制剂可以来自于钙蛋白酶-2多肽底物PTEN(SEQIDNO：1)。本专利技术还描述了这样的发现：通过不同的底物特异性和不同的亚细胞骨架，钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2有差异地与离散的细胞路径相关。特别地，申请人提供这样的证据：施用本专利技术所述的钙蛋白酶-2抑制剂有助于抑制细胞死亡和增强认知。实际上，钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2与诱导长期增强(LTP)、学习和记忆力的生理底物有差异地相联系，因为钙蛋白酶-1与诱导LTP直接相联系。因此，在与神经系统疾病的治疗相关的专利技术方面，钙蛋白酶-1激活在诱导LTP中起积极作用。而同一过程中，钙蛋白酶-2激活在LTP巩固过程中起到制动作用，从而产生了LTP的阈值，并限制了巩固期间LTP的程度。本专利技术还公开了钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2在细胞保护和细胞死亡中的特别的和差异的功能。在各个方面，本专利技术还提供了识别对钙蛋白酶-2有选择性的抑制剂的方法。这些抑制剂用于I)抑制与细胞死亡和病理学相关的细胞活性，II)降低维持LTP的阈值，III)增加LTP，IV)增强神经元突触可塑性、学习、记忆力和认知，和/或V)治疗某些神经退行性疾病。在本专利技术的方法中，选择性抑制钙蛋白酶-2的小分子抑制剂、蛋白质、肽、多肽、修饰的肽和多肽以及核酸可以单独施用，或与钙蛋白酶-2功能的其它抑制剂或者钙蛋白酶-1功能的激活剂结合，因为申请人已经发现与钙蛋白酶-2相比，钙蛋白酶-1尤其参与神经保护和突触可塑性的诱导。另一方面，本专利技术涉及产品和组合物，例如小分子抑制剂、多肽、肽、修饰的肽和核酸，其选择性地单独抑制钙蛋白酶-2或与选择性抑制钙蛋白酶-2的其它分子结合，并对钙蛋白酶-1具有降低的影响、很小的影响或测量不到的影响。在另一方面，本专利技术涉及物质的产品和组合物，例如小分子抑制剂、多肽、肽、修饰的多肽和核酸，其选择性地单独激活或抑制钙蛋白酶-1功能或与其它激活剂或选择性抑制剂结合。总之，本专利技术提供了治疗易被钙蛋白酶-2选择性抑制剂或钙蛋白酶-1选择性激活剂或其结合抑制、改善、延迟、逆转或预防的疾病的方法。附图说明图1示出了钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2在LTP和神经退行疾病中的相应作用。图2：在存在或不存在通用钙蛋白酶抑制剂、钙蛋白酶抑制剂III(ZVal-Phe-CHO)的情况下，在急性大鼠海马切片中区域CA1的辐射层中进行的兴奋性突触后电位(EPSP)的现场记录。结果以10分钟基线后平均值的百分比表示，并且是实验指定数量的平均±S.E.M。在LTP诱导前施用钙激蛋白酶抑制剂III时，其阻断LTP。闭环(钙蛋白酶抑制剂III)与闭环(对照)相比较。图3A：在存在或不存在200nM式I的钙蛋白酶-2选择性抑制剂(图中的m钙蛋白酶-I)的情况下，在急性大鼠海马切片中区域CA1的辐射层中进行的兴奋性突触后电位(EPSP)的现场记录。用m钙蛋白酶-I预孵育增强了LTP。结果以10分钟基线后平均值的百分比表示并且是是实验指定数量的平均±S.E.M。图3B：用式I的高选择性钙蛋白酶-2抑制剂(图本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含药学上可接受的赋形剂和下式分子的组合物：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.11 US 62/078,2211.包含药学上可接受的赋形剂和下式分子的组合物：其中：M1是-O、-N、-S或-C被取代以共价连接选自Y1-PhCH2-、Y1-Ph(CH2)2-、PhCH2-Y1或Ph(CH2)2-Y1-的封闭基团，其中Y1是共价连接的多肽或修饰的多肽，用于改善半衰期、生物利用度或靶向；或者其中Y1是-H，用于连接小分子、多肽或修饰的多肽部分的取代，用于改善半衰期、生物利用度或靶向；或者Y1是连接多肽的-O、-N、-S或-C取代，所述多肽改善膜的渗透性或血脑屏障通道，选自(SEQIDNOs：195-200)转移多肽片段、胰岛素片段、LDL结合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段，或者，M1是-O、-N、-S或-C被取代以共价连接小分子、多肽或修饰的多肽，所述小分子、多肽或修饰的多肽改善膜的渗透性或血脑屏障通道，选自SEQIDNO：(195-200)、转移多肽片段、胰岛素片段、LDL结合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；R1是与α-碳共价键合的官能团，所述α-碳具有L取向，并具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸氨基酸侧链或修饰的氨基酸侧链；且R2是-CH3、-CH2CH3、-(CH2)2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-C6H5、-C6H4(4-OH)、C6H4(3-OH)、C6H4(2-OH)、C6H4(2-CH3)、C6H4(3-CH3)、C6H4(4-CH3)、C6H4(2-OCH3)、C6H4(3-OCH3)、C6H4(4-OCH3)、C6H4(2-NH2)、C6H4(3-NH2)、C6H4(4-NH2)、C6H4(2-NHCH3)、C6H4(3-NHCH3)、C6H4(4-NHCH3)、C6H4(2-N(CH3)2)、C6H4(3-N(CH3)2)或C6H4(4-N(CH3)2)；R3是-H、-OCH3、＝NH、-NH2、-SH、＝O、＝S、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-SCH3、-SCH2CH3、-S(CH2)2CH3、-SCH(CH3)2、-OH、-CH3、-F、-Cl、–Br、-I；X1是-C6H3(3,5-R4,R5)、-CHR6-C6H3-(3,5-R4,R5)、-2-吡啶、-2-吡啶(3,5，R4,R5)、-CHR6-2-吡啶(3,5,R4,R5)、-3-吡啶(3,5,R4,R5)、-CHR6-3-吡啶(3,5,R4,R5),-4-吡啶(3,5,R4,R5)或-CHR6-4-吡啶(3,5,R4,R5)；其中R4是-H、-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-SCH3、SCH2CH3、S(CH2)2CH3、-SCH(CH3)2、-OH、-CH3、-CH2CH3、-CN、-CHNH、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-F、-Cl、-Br或-I；R5是-H、-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-SCH3、SCH2CH3、-S(CH2)2CH3、-SCH(CH3)2、-OH、-CH3、-CH2CH3、-CN、-CHNH、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-F、-Cl、-Br或-I；且R6是-H、-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-SCH3、-SCH2CH3、-S(CH2)2CH3、-SCH(CH3)2、-OH、-CH3、-CH2CH3、-CN、-CHNH、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-F、-Cl、-Br或-I。2.包含药学上可接受的赋形剂和下式分子的组...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·博德里，X·毕，S·斯坦德利，L·罗，Y·王，G·朱，V·布里斯，
申请(专利权)人：健康科学西部大学，
类型：发明
国别省市：美国,US