本发明专利技术涉及生物医学材料技术领域，是一种小ＲＮＡ分子ｍｉＲ－４９４抑制剂在制备抗骨质丢失、促骨生成制剂中的应用。经实验证实，ｍｉＲ－４９４通过作用于成骨细胞分化相关的重要转录因子Ｒｕｎｘ２基因，抑制该基因不能表达相应蛋白，从而抑制成骨细胞的分化，引起成骨分化障碍，导致骨质丢失和骨质疏松的发生。ｍｉＲ－４９４的抑制剂能下调ｍｉＲ－４９４的表达丰度，解除ｍｉＲ－４９４对成骨分化的抑制作用、促进成骨，因而可将ｍｉｒ－４９４抑制剂用于制备抗骨质丢失、促骨生成制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学材料
，是一种小RNA分子miR-494抑制剂在制备抗 骨钙丢失、促骨生成制剂中的应用。
技术介绍
微小RNA(microRNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为18_25个核苷酸的非编码 小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA 的降解或翻译抑制。到目前为止，已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞 真核生物中，进化上高度保守。miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异 性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过 程中起多种作用(Ambros V. The functions of animal microRNAs. Nature. 2004 S印 16 ; 431(7006) :350-5.)。与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达(哺乳动物中比 较普遍)。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种 机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补(或 者几乎完全互补)，那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见)。 通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。每个 miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既 可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某 个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生 物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节了细胞生长，组 织分化，因而与生命过程中发育、疾病有关。通过对基因组上miRNA的位点分析，显示其在 发育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明miRNAs在细胞生长和凋亡，血细 胞分化，同源异形盒基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，心脏发生，胚胎 后期发育等过程中发挥重要作用。例如，miR-273和lys-6编码的miRNA，参与线虫的神经 系统发育过程；miR-430参与斑马鱼的大脑发育；miR-181控制哺乳动物血细胞分化为B细 胞；miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143在脂肪细胞分化起作用； miR-196参与了哺乳动物四肢形成，miR-1与心脏发育有关。另有研究人员发现许多神经系 统的miRNAs在大脑皮层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。对 于新的miRNA基因的分析，可能发现新的参与器官形成、胚胎发育和生长的调节因子，促进 对癌症等人类疾病发病机制的理解。但是目前尚未见关于miR-494抑制剂用于制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂的任何 报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供miR-494抑制剂用于抑制骨钙丢失、促骨生成的新用途。本专利技术为实现上述专利技术目的，以模拟失重条件下成骨细胞出现骨分化障碍作为骨 钙丢失的实验模型，首先采用荧光实时定量PCR技术检测了模拟失重环境下小鼠MC3T3-E1 细胞miR-494的表达情况，结果发现在模拟失重24h后miR-494的表达量显著上调。进一 步的研究结果表明，在正常环境下通过BMP2诱导具有成骨细胞分化潜能的小鼠C2C12细胞 的过程中，miR-494的表达丰度明显下降。上述结果提示miR-494可能参与了对成骨细胞 分化的抑制。在此基础上，本专利技术将miR-494 mimics (miR-494模拟物)和 miR-494inhibitor (miR-494抑制剂)转染入C2C12细胞后通过BMP2诱导成骨分化，通过检 测成骨细胞分化的指标判断miR-494对细胞成骨分化的影响。研究结果发现，转染miR-494 模拟物实验组，标志成骨分化的ALP表达量和活性均下调，0C、OPG、Runx2等分化指标也有 明显下调；而转染miR-494抑制剂实验组，ALP、0C、Runx2表达上调，OPG无明显变化。上述 研究结果表明miR-494可以抑制成骨细胞分化，引起骨钙丢失，而miR-494抑制剂则能促进 成骨分化。为了探讨miR-494抑制成骨细胞分化的可能分子机制，本专利技术结合国际上通用的 3种miRNA靶基因预测软件(pictar，miRanda，Targetscan)对miR-494的潜在靶基因进行 了预测，并从预测结果种筛选出了可能与miR-494抑制成骨细胞分化功能相关的候选靶基 因——Runx20之后本专利技术设计了相应的实验来验证Runx2是否是miR-494的靶基因。瞬时 转染miR-494模拟物后发现Runx2在mRNA和蛋白水平均发生了显著降低，而转染miR-494 抑制剂后，Runx2的表达水平有所升高，说明miR-494通过下调Rimx2抑制成骨细胞分化， 而其抑制剂可以促进成骨细胞分化、抑制骨钙丢失。本专利技术的技术解决方案是:miR-494抑制剂在制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂中 的应用附图说明图1荧光实时定量PCR检测模拟失重C2C12细胞miR-494表达丰度图。图2瞬时转染miR-494模拟物抑制成骨分化相关指标结果图。图3miR_494抑制剂能增强成骨相关基因ALP活性的检测结果图。图4miR-494抑制剂能增强成骨相关基因OC表达的ELISA检测结果图。图5双荧光报告系统检测Runx2是miR-494靶基因结果图。图6Westen blot验证Runx2是miR-494靶基因结果图。具体实施例方式1.回转器模拟失重条件下的细胞培养本专利技术中采用的细胞回转器具有两组不同方向的转台——水平转台和垂直转台， 两组转台通过传动装置连接于同一个电机上实现同速旋转。水平转台在水平方向上旋转以 模拟微重力，而垂直转台围绕与地面垂直的轴向旋转以在相同动力环境中作为IG对照，同 时可以排除如振动等动力学因素的影响，本实验同时在37°C培养箱中设静止对照。含培养细胞的回转舱可以固定在转台上从而给予细胞模拟失重刺激或IG对照。C2C12细胞在25cm2培养瓶中，采用含10% FBS DMEM培养液，在含5% C02的37°C 恒温培养箱中按常规培养。在进行模拟失重实验前一天，将细胞以每片IXIO5个细胞的密 度接种于2. 5cmX 3cm的盖玻片上(盖玻片预先经过多聚赖氨酸包被及灭菌处理)，将盖玻 片置于六孔板中在5% C02的37°C恒温培养箱中过夜培养。之后将接种有细胞的盖玻片插 在固定架上，置于装满10% FBS DMEM培养液的回转舱中，排除气泡，密封舱口，回转器置于 37°C恒温培养箱以30rpm旋转。细胞在不同重力环境培养48_72h后，进行后续实验。2.细胞总RNA的提取收获对数生长期的C2C12细胞约107，加入Iml TRIZOL裂解细胞并用吸管反复吹 吸，室温作用5min。将细胞转至1. 5ml离心管中，加入0. 2ml氯仿，盖紧离心管盖，漩涡振荡 器上用力震摇15sec，室温放置3min，4°C以12，000Xg的转速离本文档来自技高网...
【技术保护点】
ｍｉＲ－４９４抑制剂在制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨安钢，王涛，秦炜炜，张瑞，赵智凝，白久旭，闫博，孟艳玲，贾林涛，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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