单克隆抗体STRO‑4制造技术

本发明专利技术涉及一种称为STRO‑4的单克隆抗体及其用于富集诸如间充质前体细胞(MPC)的多潜能细胞的用途，所述单克隆抗体特异性结合人和绵羊HSP‑90β。

Monoclonal antibody STRO 4

The invention relates to a monoclonal antibody called STRO 4 and for the enrichment of somatic cells such as mesenchymal (MPC) between the use of pluripotent cells, the monoclonal antibody specific binding of human and sheep HSP 90 beta.

【技术实现步骤摘要】
单克隆抗体STRO-4本申请是2009年8月18日提交的题为“单克隆抗体STRO-4”的中国专利申请200980141163.9的分案申请。
本专利技术涉及热休克蛋白-90β(HSP-90β)作为鉴定和/或分离多潜能细胞的标记物的用途。更具体地，本专利技术涉及特异性结合人和绵羊HSP-90β的单克隆抗体(称为STRO-4)的鉴定。本专利技术还涉及通过本专利技术的方法富集的细胞群和这些细胞的治疗用途。专利技术背景包含造血支持性骨髓基质和相关骨组织的细胞组分源自一群多潜能细胞，该多潜能细胞包括多潜能间充质干细胞(MSC)和它们的前体(间充质前体细胞(MPC))。MPC存在于主要位于环绕血管的血管周围生态位的骨髓空间中(GronthosSetal.,2003和ShiSetal.,2003)。在过去二十年中，研究集中于不同人基质/间充质细胞群重建脂肪、骨、软骨和肌肉的再生潜能(GronthosSetal.,2003和SimmonsPJetal.,1991)。但是，这些技术的成功应用取决于以下能力：分离纯化的MPC群，以及随后离体控制它们的生长和分化。此外，需要克服通常与基于干细胞的疗法有关的各种技术和安全性顾虑，这通过在合适的大量人疾病临床前动物模型代表中评价MPC制品(preparation)的安全性和功效实现。人矫形和心脏疾病/创伤的绵羊模型已得到广泛使用，因为绵羊与人解剖、生理、免疫学和胚胎发育具有相似性(AireyJAetal.,2004；LiechtyKWetal.,2000和MackenzieTCetal.,2001)。同时，数种人多潜能细胞特异性标记物如STRO-1、CD106、CD146已经在文献中进行了描述(GronthosSetal.,2003和ShiSetal.,2003)，在人疾病绵羊模型中检查多潜能细胞的治疗潜力的显著进展受到限制，这是因为缺乏允许分离和表征绵羊组织中等同的多潜能细胞群的特异性试剂。诸如单克隆抗体的与绵羊和人多潜能细胞均反应的生物学试剂的开发分别会极大促进在临床前和临床试验中监测和等同绵羊和人多潜能细胞群的功能性的能力。已包括在本说明书中的关于文献、法规、材料、装置、论文等的任何讨论只是为了提供本专利技术的背景。其不应被视作承认任何或全部这些内容由于存在于本申请每项权利要求的优先权日之前而构成现有技术基础的一部分或是本专利技术相关领域的公知常识。专利技术概述本专利技术描述了一种称为STRO-4的新单克隆抗体(mAb)的产生和表征，该单克隆抗体从未分级的绵羊和人骨髓鉴定和分离多潜能细胞。具体地，STRO-4抗体能够在两个物种中基本上分离全部产克隆多潜能细胞(CFU-F：成纤维细胞集落形成单位)。分离的多潜能细胞表现出高增殖潜能和多谱系分化。出人意料的，本专利技术人发现热休克蛋白-90β(HSP-90β)蛋白在体内多潜能细胞的细胞表面表达，并且据发现单克隆抗体STRO-4鉴定HSP-90β上表达的独特表位。因此，在一实施方案中，本专利技术提供了HSP-90β作为鉴定和/或富集多潜能细胞的标记物的用途。在一实施方案中，本专利技术提供了一种富集多潜能细胞的方法，所述方法包括从组织来源制备细胞样品并且富集表达所述HSP-90β标记物的细胞。在本专利技术的一实施方案中，多潜能细胞是成体多潜能细胞。在一实施方案中，本专利技术的富集的细胞群没有被体外培养。在另一实施方案中，本专利技术的富集的细胞群能够产生产克隆CFU-F。在另一实施方案中，富集的细胞群对于HSP-90β+/STRO-4+细胞是同质(homogenous)的。在一个实例中，富集多潜能细胞的方法包括：使细胞样品与HSP-90β结合剂接触；和将结合所述HSP-90β结合剂的细胞与不结合所述HSP-90β结合剂的细胞分离。在另一实施方案中，本专利技术还提供了一种鉴定细胞样品中多潜能细胞的存在的方法，所述方法包括鉴定样品中表达所述HSP-90β标记物的细胞。在一实例中，鉴定细胞样品中多潜能细胞存在的方法包括：从组织来源获得细胞样品；在适合于HSP-90β与所述HSP-90β结合剂结合的条件下，使所述细胞样品与HSP-90β结合剂接触；和检测结合所述样品中细胞的HSP-90β结合剂的存在，其中结合所述HSP-90β结合剂的细胞指示多潜能细胞的存在。细胞样品可以源自疑似含有多潜能细胞的任何组织来源。例如，组织来源可以是胎盘、脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、卵巢、胰、骨、韧带、骨髓、腱或骨骼肌。在优选实施方案中，组织来源是骨髓。富集多潜能细胞的细胞来源可以是人或绵羊来源。但是，本专利技术还适用于源自其他动物物种的细胞，包括牛、马、鼠、猪、犬或猫。本专利技术还涉及从本专利技术多潜能细胞的体外培养产生的子代细胞。本专利技术的扩增的细胞可以具有多种表型，这取决于培养条件(包括培养基中刺激因子的数量和/或类型)、传代次数等。在另一实施方案中，培养本专利技术的富集群产生还表达选自以下标记物的一种或多种标记物的多潜能细胞：STRO-1、STRO-3(TNSAP)、LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、整合蛋白β、6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦蛋白-R、(STRO-2＝瘦蛋白-R)、RANKL、STRO-1bright和CD146或这些标记物的任意组合。在本专利技术的另一实施方案中，本专利技术的多潜能细胞在培养时不能产生造血细胞。本专利技术的方法还可以包括在第一富集步骤之前收获多潜能细胞来源的步骤。这可以包括，例如从受试者手术取出组织，并且从该组织分离细胞以形成单细胞悬液。这种分离可以通过物理或酶促方式实现。这类方式是本专利
的技术人员熟知的。在本专利技术的一实例中，这个步骤涉及使用已知技术收集骨髓细胞。用于本专利技术方法的HSP-90β结合剂可以是鉴定为具有对HSP-90β的结合亲和力的任何多肽或化合物。优选地，HSP-90β结合剂特异性结合HSP-90β。优选地，HSP-90β结合剂特异性结合HSP-90β上的表位，其中HSP-90β包含与SEQIDNO:1(图5)的序列至少约75％相同的序列，优选与SEQIDNO:1至少约78％相同，更优选至少约80％相同，仍然更优选至少约85％相同，仍然更优选至少约90％相同，甚至更优选与SEQIDNO:1至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。在一实施方案中，HSP-90β结合剂选自肽、拟肽类(peptidomimetic)、核酸适配体、肽适配体、树状聚体和小有机分子。在一实例中，HSP-90β结合剂是寡核苷酸。优选地，寡核苷酸是标记的寡核苷酸。在另一实施方案中，HSP-90β结合剂是纯化的抗HSP-90β抗体或其抗原结合片段或衍生物。抗HSP-90β抗体可以是单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在本专利技术的一实施方案中，抗HSP-90β单克隆抗体是由杂交瘤细胞系产生的STRO-4抗体，所述杂交瘤细胞系依据布达佩斯条约(Budape本文档来自技高网...

【技术保护点】
HSP‑90β作为鉴定和/或富集多潜能细胞的标记物的用途。

【技术特征摘要】
2008.08.18 US 61/189,3491.HSP-90β作为鉴定和/或富集多潜能细胞的标记物的用途。2.一种富集多潜能细胞的方法，所述方法包括从组织来源制备细胞样品并且富集表达所述HSP-90β标记物的细胞。3.权利要求2的方法，其中富集表达所述HSP-90β标记物的细胞包括：使细胞样品与HSP-90β结合剂接触；和将结合所述HSP-90β结合剂的细胞与不结合所述HSP-90β结合剂的细胞分离。4.一种鉴定细胞样品中多潜能细胞的存在的方法，所述方法包括鉴定样品中表达所述HSP-90β标记物的细胞。5.权利要求4的方法，其中样品中表达所述HSP-90β标记物的细胞的鉴定包括：从组织来源获得细胞样品；在适合于HSP-90β与所述HSP-90β结合剂结合的条件下，使所述细胞样品与HSP-90β结合剂接触；和检测结合所述样品中细胞的HSP-90β结合剂的存在，其中结合所述HSP-90β结合剂的细胞指示多潜能细胞的存在。6.权利要求2至5中任一项的方法，其中所述细胞样品源自胎盘、脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、卵巢、胰、骨、韧带、骨髓、腱或骨骼肌。7.权利要求2的方法，其中所述方法还包括在制备细胞样品的步骤之前收获多潜能细胞来源的步骤。8.权利要求2至5中任一项的方法，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合片段或衍生物。9.权利要求8的方法，其中所述抗体是由杂交瘤细胞系产生的STRO-4抗体，所述杂交瘤细胞系依据布达佩斯条约的条款于2008年7月10日保藏于ATCC，保藏登录号为PTA-9362。10.权利要求8或9的方法，其中所述结合剂是所述STRO-4抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·格龙索斯，A·C·W·赞内蒂诺，
申请(专利权)人：中胚有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US