间充质前体细胞已经利用血管周围标记从广泛的组织中从血管周围微环境中分离。本发明专利技术描述了一种新的间充质前体细胞表型，其特征在于存在血管周围标记3G5，优选还存在α-平滑肌肌动蛋白及早期发育标记如MUC18、VCAM-1和STRO-1bri。血管周围间充质前体细胞是多能的并且显示出形成血管组织以及骨髓、牙本质和牙髓。本发明专利技术还描述了一种基于这些标记而使用细胞分选进行富集的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及间充质前体细胞，及携带血管周围标记的这种前体细胞亚群的分离。
技术介绍
由于间充质前体细胞(mesenchymal precursor cell)在医学应用方面的潜力，针对分离和富集间充质前体细胞已经进行了许多尝试。Pittinger et al.，(1999)显示出克隆发生细胞(clonogenic cell)从骨髓中的扩增，并描述了扩大的间充质干细胞的制备。这种方法的最近实例提供了从骨髓中相对高产量生产的方法，见Simmons等的公开WOO1/04268 所述。然而，迄今为止还未有可以从广泛的组织中分离间充质前体细胞的方法的实例。专利技术概述本专利技术建立在发现多能间充质前体细胞(MPC)群存在于血管周围微环境(perivascular niche)中的基础上。W001/0426指出除了单一的组织骨髓之外还有MPC来源的更广泛的组织类型。本专利技术建立在另外发现富集的MPC群可以分化为由标记3G5区别的两种群体的基础上。认为3G5阳性的MPC特别用于新血管形成，尽管它们确实也显示出分化为其它组织类型。本专利技术另外发现本专利技术的优选的富集细胞群中存在的MPC的水平能产生足够数目的定型细胞(com mitted cell)以提供许多分化的组织类型。本专利技术第一方面的第一种形式涉及一种富集间充质前体细胞(MPC)的方法，所述方法包括制备从血管化的源组织(vascularized source tissue)中制备单细胞悬浮液的步骤，及基于早期血管周围细胞标记的存在进行富集的步骤。本专利技术第一方面的第二种形式涉及一种富集间充质前体细胞的方法，所述方法包括从非骨髓的血管化的源组织中制备单细胞悬浮液的步骤，及将组织分离成单独的细胞的步骤，以及基于一或多个早期发育标记的存在或水平和表示定型的一或多个表面标记的不存在而进行富集的步骤。本专利技术第一方面的第三种形式涉及一种富集间充质前体细胞(MPC)的方法，所述方法包括从血管化的源组织中制备单细胞悬浮液的步骤，及基于在血管化的组织中由血管周围细胞表达的标记的存在情况而进行富集。本专利技术的第二方面涉及一种富集间充质前体细胞(MPC)的富集的细胞群，所述MPC具有3G5、MUC18、VCAM-USTRO-1bri和α -平滑肌肌动蛋白的表型。本专利技术第三方面的第一种形式涉及一种分离的间充质前体细胞(MPC)，所述MPC具有3G5、MUC18、VCAM-USTRO-1blri和α -平滑肌肌动蛋白的表型。本专利技术的第三方面的第二种形式涉及一种分离的哺乳动物细胞，其是多能的并且对于表面标记3G5是阳性的。本专利技术的第三方面的第三种形式涉及一种间充质前体细胞(MPC)，其能形成克隆发生集落(clonogenic colony)并分化为三或多种间充质组织类型,分离自包含但不限于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌的组织，并且对于表面标记STRO-1是阳性的。本专利技术的第三方面的第四方面涉及一种富集间充质前体细胞(MPC)的未被扩增的细胞群，其能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型，所述MPC共表达表面标记MUC18/⑶146和α -平滑肌肌动蛋白。本专利技术的第四方面涉及一种优选地从本专利技术的第三方面产生的分化的子代细胞，其中所述子代细胞至少是成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心脏肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。附图简述附图说明图1.用抗-⑶146(CC9)共标记的STRO-l+MACS-分离的细胞的性质。(A)分选区Rl代表双阳性的STRO-严T/CD146+细胞群。(B)基于STRO-严T/CD146+表达的克隆发生细胞集落(>50个细胞)的发生率使用泊松分布分析，从5个独立的实验中通过对每个细胞浓度的24个重复进行限制稀释分析确定。图中显示出了 BMMNC(C)、STRO-1int/⑶146_细胞(D)和STRO-1bkVcd146+细胞(E)的前向(大小)和垂直(粒度)光散射特性。(F) STRO-1bet/⑶146+分选的骨髓细胞针对CBFAl (泳道2)、骨钙蛋白(泳道4)和GAPDH(泳道6)转录体的RT-PCR分析。图中还显示出了表达CBFAl (泳道I)、骨钙蛋白(泳道3)、和GAPDH(泳道5)的对照细胞(在存在地塞米松的情况下生长的BMSSC培养物)。将反应混合物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，并通过溴化乙啶染色观测。(G)CD146在接近骨(b)表面的人骨髓(bm)切片中血管(bv)壁(箭头所指)上的原位表达，20X。切片用苏木精复染。(H)双重免疫荧光染色表明在人骨髓的冷冻切片中用德克萨斯红标记的STR0-1抗体和用异硫氰酸荧光素标记的CC9抗体与血管壁的反应性。图2:DPSC在体内的免疫表型分析。柱状图描述了在基于与识别STR0-1、⑶146、和3G5的抗体及同种型匹配的阴性对照抗体的反应性进行免疫磁珠选择之后从牙髓的单细胞悬浮液中回收的克隆发生集落的数目。数据以从三个独立的实验平均的在珠阳性细胞级分中获得的集落形成单位的数目与未分级分离的髓细胞的集落总数的百分比表示。统计学显著性(*)使用斯氏t-检验(p〈0.01)对比每个抗体与相应的同种型匹配的对照抗体的集落总数百分比而确定。图3:牙髓中血管周围标记的反应性。(A)STRO-1抗原在人牙髓(p)血管(小箭头所指)和围绕神经束(nb)的周围神经束膜(大箭头所指)上的免疫定位，20X。(B)双重免疫荧光染色表明用德克萨斯红标记的STR0-1抗体与牙髓神经束膜(箭头所指)的反应性，组合用异硫氰酸荧光素标记的抗神经丝抗体染色内部神经束(nb)，40X。(C)CD146抗原在人牙髓组织的血管壁的免疫定位，20X。(D)双重免疫荧光染色表明用德克萨斯红标记的STR0-1抗体及用异硫氰酸荧光素标记的CC9抗体与血管的反应性。(E)用兔多克隆抗DSP抗体(箭头所指)的牙髓组织对成牙本质细胞外层(od)的免疫组织化学染色，20X。(F)3G5与血管(bv)壁中单一周细胞(箭头所指)的反应性，40X。组织切片用苏木精复染色。 图4.3G5与BMSSC的反应性。㈧代表性柱状图描述了表达⑶146 (PE)和3G5 (FITC)的全骨髓单核细胞(BMMNC)的典型双重颜色FACS分析图示。(B)对于观测到的所有不同的表达模式(区域Rl — 6)进行集落效率分析(colony efficiency analysis)。数据以从三个独立实验中平均的每个细胞级分的集落形成单位的平均发生率表示。图5.纯化的BMSSC和DPSC在体内的发育潜力。MACS/FACS分离的STRO-严T/CD146+骨髓细胞的cytospin制品(箭头所指)用特异于α _平滑肌肌动蛋白(A)和冯.维勒布兰德因子(B)的抗体染色。通过免疫磁珠(小箭头所指的为磁珠)选择分离CD146+髓细胞(大箭头所指)，用特异于α-平滑肌肌动蛋白(C)和冯 维勒布兰德因子(D)的抗体染色。(E)来自衍生自与HA/TCP移植进无免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种富集的间充质前体细胞群，其中所述间充质前体细胞从血管化的组织来源内的血管周围微环境中富集，其对于早期血管周围细胞标记是阳性的，并且能产生由两或更多个组织类型组成的子代。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯坦·格龙索斯，安德鲁·赞内蒂诺，施松涛，
申请(专利权)人：中胚有限公司，
类型：发明
国别省市：
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