无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达PPRV H/F蛋白疫苗的构建技术方案

本发明专利技术公开了一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达PPRV H/F蛋白疫苗的构建，该重组系统不但可以构建单表达、双表达的重组病毒或重组疫苗，甚至可以构建表达三个蛋白以上的重组病毒或重组疫苗，由该重组系统获得的重组病毒，不需要任何筛选标签，避免了筛选标签对疫苗使用中存在的一些潜在不利影响。此外，本发明专利技术还公开了通过该重组系统制备的双表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒，研究结果表明，该重组病毒能够诱导比单抗原表达更全面的细胞和体液免疫，能够同时预防PPR和羊痘两种重大疫病，且诱导的足够高的中和抗体有利于免疫血清学监测，因此在预防及治疗小反刍兽疫和山羊痘方面将具有良好的应用前景。

Without plaque screening and cloning of Recombinant Goat Pox Virus label mountain system and the double expression of PPRV H/F protein vaccine

The invention discloses a without plaque screening and cloning of Recombinant Goat Pox Virus label mountain system and the double construction of expression PPRV H/F protein vaccine, the recombinant expression system of single and double expression of recombinant virus or recombinant vaccine can not only, can even build the expression of the three proteins of the recombinant virus or recombinant vaccine. The recombinant virus obtained by the recombination system, does not require any screening labels, avoid screening of vaccine label use some potential adverse effects. In addition, the invention also discloses the preparation of recombinant system double expression of Peste des petits ruminants virus H and F protein and recombinant goat pox virus screening label, the results of the study show that the recombinant virus can induce than single antigen expressing cells and humoral immunity is more comprehensive, can prevent PPR and pox two epidemic, and sufficient for the induction of neutralizing antibodies to high serological monitoring, so it will have a good application prospect in the prevention and treatment of Peste des petits ruminants and goat pox.

【技术实现步骤摘要】
无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达PPRVH/F蛋白疫苗的构建
本专利技术涉及一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统，还涉及由此系统构建得到的双表达小反刍兽疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)H和F蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒疫苗及其构建方法和应用，本专利技术属于医药

技术介绍
小反刍兽疫(Pestedespetitsofruminants，PPR)和山羊痘(Goatpox，GP)是分别由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的小反刍兽疫病病毒(Pestedespetitsofruminants，PPRV)和正痘病毒科(Orthopoxvirus)山羊痘病毒属(Capripoxvirus)的山羊痘病毒(goatpoxvirus，GPV)引起的危害绵羊和山羊等小反刍动物的2种重大疫病。其中PPR长期以来一直在非洲、中东、中亚、南亚及东南亚地区流行，该病作为一种危害巨大的跨国动物疫病，2007年传入我国西部边境地区并导致疫情发生。2013年12月至2014年，我国15个以上省份发生小反刍兽疫疫情造成重大的经济损失。同时，山羊痘多年来在世界和我国大部分地区表现为地方流行性，由于其降低产奶量、导致流产、损坏羊毛等，也造成了严重的经济损失。其和小反刍兽疫都是OIE必须通报的重大疫病。PPRV结构蛋白中的血凝蛋白(H)蛋白和融合蛋白(F)是病毒两个重要的糖蛋白，介导病毒传染及激发宿主的免疫保护作用。其中H蛋白作为病毒和宿主细胞膜结合过程中的受体，具有调节病毒吸附并渗入寄主细胞的作用，并刺激机体产生中和抗体，参与体液免疫，是机体主要的保护性抗原，也是引起宿主细胞发生病变的主要决定因素。F糖蛋白具有细胞融合活性，是决定病毒感染成功与否的关键因素，能够引起病毒诱导的细胞病变，还具有病毒诱导细胞溶血素、细胞溶合和启动感染等其他生物学活性，也是PPRV诱导中和抗体形成的主要免疫原。F蛋白诱导的中和抗体水平较H蛋白低，主要参与细胞免疫，即使很低的中和抗体水平也能够提供PPR强毒攻击保护。因此，能够同时表达PPRVH/F蛋白的重组山羊痘病毒免疫羊可以提供更加全面的免疫保护。但是之前构建的小反刍兽疫重组病毒，一般只表达H或F其中一种蛋白，或将H和F蛋白进行融合(可能会导致抗原性发生变化)提供的免疫保护并不全面，增加病毒在免疫压力不足情况下产生变异突变的概率，从而产生新的免疫逃避机制。山羊痘病毒弱毒疫苗预防GP安全有效。目前，山羊痘病毒已被广泛用作活疫苗载体，其具有以下优点：基因组庞大约150kb，遗传稳定；其胸苷激酶(TK)基因编码区为复制非必需区，可允许大容量的外源基因插入和表达(至少25kb)；GPV感染宿主谱狭窄，只感染羊等小反刍动物；生产成本低廉、储藏运输无需冷冻、使用方便；特别重要的是，采用GP弱毒疫苗为载体构建PPR-GP重组二联活疫苗，可同时预防GP、绵羊痘和PPR，实现一种活毒疫苗预防多种烈性传染病，而且能够作为DIVA(DifferentiatingInfectedfromVaccinatedAnimals)疫苗使用来区分自然感染和疫苗免疫感染，对中国广大非疫区的PPR血清学监测极为重要。目前，羊痘病毒作为载体已经用于构建重组疫苗，如狂犬病重组疙瘩皮肤病病毒疫苗(疙瘩皮肤病为羊痘病毒一个亚型)、牛瘟重组山羊痘病毒疫苗、蓝舌病毒重组山羊痘病毒疫苗、小反刍兽疫重组山羊痘病毒疫苗等，都显示了良好的免疫效果。虽然传统的PPR弱毒疫苗能够提供充分的保护效力，但是其由于不能够作为DIVA疫苗区分自然感染和疫苗接种感染，干扰该病的血清学监测，影响该病的净化和根除。针对PPR，已有诸多报道采用各种病毒载体PPR重组疫苗，如分别表达PPRV全长融合蛋白(F)和血凝蛋白(H)的重组牛痘病毒疫苗(MVA-H,MVA-F)，表达PPRVH蛋白的重组羊痘病毒疫苗，以腺病毒为载体表达PPRVH和F蛋白的重组病毒疫苗(rAd-H,rAd-F,rAd-F-H)等，这些都是单基因表达，或者将H和F蛋白融合后表达(可能会影响蛋白结构进而影响抗原性)，不能提供天然、全面的免疫保护。其中羊痘作为载体的时候，由于其容易聚集、不易分散，需要复杂的纯化过程，包括反复药物筛选、噬斑克隆、超声分散等方法综合使用。在之前本专利技术专利技术人构建的表达PPRVH或F蛋白的重组山羊痘病毒的过程中，进行了10代次以上的纯化，工作量巨大。同时，为了易于纯化，使用了绿色荧光蛋白(GFP)作为示踪标签和gpt作为药物筛选基因，使得插入序列更长，额外增加了不必要的免疫原，这对重组病毒疫苗将来的临床应用埋下潜在的不利影响。为了克服山羊痘重组病毒构建方法的缺点，并同时构建提供更全面免疫原性的同时表达小反刍兽疫H和F蛋白的重组山羊痘病毒，本专利技术在世界范围内首次建立了无需噬斑克隆和无筛选标记的创新的重组山羊痘病毒构建系统，并利用其构建了双表达PPRVH和F蛋白的重组山羊痘病毒，最后对其免疫原性进行了评估。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统。本专利技术的目的之二在于提供由所述系统构建得到的双表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒疫苗及其构建方法和应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统，包括以下部分：(1)重组山羊痘病毒：所述的重组山羊痘病毒的TK基因中依次插入有ApaI酶切位点、eGFP基因、IRES序列、gpt基因、p11启动子序列、p7.5启动子序列以及NotI酶切位点，命名为rGPV-NA；(2)用于插入外源基因的双表达质粒载体：所述的双表达载体按照以下方法构建得到：以TK-f和TK-r为引物，以提取的GPV基因组为模板，扩增TK基因，并克隆至XhoI和EcoRI双酶切的Psp72质粒，命名为Psp72-TK；以P7.5-4-f和P7.5-4-r为引物、质粒pTK-gpt-ires-eGFP为模板PCR扩增P7.5启动子片段，命名为P7.5-4；同时以pSP72-TK-f和pSP72-TK-r为引物，以pSP72-TK质粒为模板，PCR扩增出pSP72-TK片段；将pSP72-TK片段和P7.5-4片段分别用NheI和SacI双酶切并连接，获得质粒pSP72-TK-P7.5-4；以P7.5-interval-f和P7.5-interval-r为引物，以PPRV基因组全长cDNA克隆为模板，扩增用于隔开两个P7.5启动子的间隔序列P7.5-interval；以p7.5-5-f和p7.5-5-r为引物，质粒pTK-gpt-ires-eGFP为模板，PCR扩增P7.5启动子片段，命名为P7.5-5；以pSP72-TK-P7.5-4-f和pSP72-TK-P7.5-4-r为引物，以质粒pSP72-TK-P7.5-4为模板，PCR扩增出pSP72-TK-P7.5-4片段；采用一步克隆法试剂盒将以上P7.5-interval、P7.5-5和pSP72-TK-P7.5-4连接到一起，获得用于插入外源基因的双表达质粒载体，命名为pTK-P7.5-4-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统，其特征在于包括：(1)重组山羊痘病毒：所述的重组山羊痘病毒的TK基因中依次插入有ApaI酶切位点、eGFP基因、IRES序列、gpt基因、p11启动子序列、p7.5启动子序列以及NotI酶切位点，命名为rGPV‑NA；(2)用于插入外源基因的双表达质粒载体：所述的双表达载体按照以下方法构建得到：以TK‑f和TK‑r为引物，以提取的GPV基因组为模板，扩增TK基因，并克隆至Xho I和EcoRI双酶切的Psp72质粒，命名为Psp72‑TK；以P7.5‑4‑f和P7.5‑4‑r为引物、质粒pTK‑gpt‑ires‑eGFP为模板PCR扩增P7.5启动子片段，命名为P7.5‑4；同时以pSP72‑TK‑f和pSP72‑TK‑r为引物，以pSP72‑TK质粒为模板，PCR扩增出pSP72‑TK片段；将pSP72‑TK片段和P7.5‑4片段分别用NheI和SacI双酶切并连接，获得质粒pSP72‑TK‑P7.5‑4；以P7.5‑interval‑f和P7.5‑interval‑r为引物，以PPRV基因组全长cDNA克隆为模板，扩增用于隔开两个P7.5启动子的间隔序列P7.5‑interval；以p7.5‑5‑f和p7.5‑5‑r为引物，质粒pTK‑gpt‑ires‑eGFP为模板，PCR扩增P7.5启动子片段，命名为P7.5‑5；以pSP72‑TK‑P7.5‑4‑f和pSP72‑TK‑P7.5‑4‑r为引物，以质粒pSP72‑TK‑P7.5‑4为模板，PCR扩增出pSP72‑TK‑P7.5‑4片段；采用一步克隆法试剂盒将以上P7.5‑interval、P7.5‑5和pSP72‑TK‑P7.5‑4连接到一起，获得用于插入外源基因的双表达质粒载体，命名为pTK‑P7.5‑4‑5‑double质粒；...

【技术特征摘要】
1.一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统，其特征在于包括：(1)重组山羊痘病毒：所述的重组山羊痘病毒的TK基因中依次插入有ApaI酶切位点、eGFP基因、IRES序列、gpt基因、p11启动子序列、p7.5启动子序列以及NotI酶切位点，命名为rGPV-NA；(2)用于插入外源基因的双表达质粒载体：所述的双表达载体按照以下方法构建得到：以TK-f和TK-r为引物，以提取的GPV基因组为模板，扩增TK基因，并克隆至XhoI和EcoRI双酶切的Psp72质粒，命名为Psp72-TK；以P7.5-4-f和P7.5-4-r为引物、质粒pTK-gpt-ires-eGFP为模板PCR扩增P7.5启动子片段，命名为P7.5-4；同时以pSP72-TK-f和pSP72-TK-r为引物，以pSP72-TK质粒为模板，PCR扩增出pSP72-TK片段；将pSP72-TK片段和P7.5-4片段分别用NheI和SacI双酶切并连接，获得质粒pSP72-TK-P7.5-4；以P7.5-interval-f和P7.5-interval-r为引物，以PPRV基因组全长cDNA克隆为模板，扩增用于隔开两个P7.5启动子的间隔序列P7.5-interval；以p7.5-5-f和p7.5-5-r为引物，质粒pTK-gpt-ires-eGFP为模板，PCR扩增P7.5启动子片段，命名为P7.5-5；以pSP72-TK-P7.5-4-f和pSP72-TK-P7.5-4-r为引物，以质粒pSP72-TK-P7.5-4为模板，PCR扩增出pSP72-TK-P7.5-4片段；采用一步克隆法试剂盒将以上P7.5-interval、P7.5-5和pSP72-TK-P7.5-4连接到一起，获得用于插入外源基因的双表达质粒载体，命名为pTK-P7.5-4-5-double质粒；(3)用于病毒重组的宿主细胞。2.如权利要求1所述的山羊痘病毒重组系统，其特征在于，所述的重组山羊痘病毒通过以下方法制备得到：(1)穿梭质粒pTK-NA的构建：以NA-f和NA-r为引物和质粒pTK-gpt-ires-eGFP为模板，扩增gpt-ires-eGFP序列，并在两端分别引入NotI和ApaI酶切位点；以pTK-f和pTK-r为引物和pTK-gpt-ires-eGFP为模板，扩增包含质粒和TK基因的PCR片段，命名为pTK；用一步克隆试剂盒将含有NotI和ApaI酶切位点的gpt-ires-eGFPPCR片段和pTKPCR片段连接，获得穿梭质粒，命名为pTK-NA；(2)重组山羊痘...

【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，陈伟业，胡森，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23