一种新型Fndc5基因敲除小鼠模型的创建制造技术

本发明专利技术公开了一种新型Fndc5基因敲除小鼠模型的创建方法，属于病理动物模型的药理用途领域。本发明专利技术通过TALEN技术，使Fndc5基因DNA序列发生移码突变，从而蛋白质发生相应的移码突变，导致提前产生终止密码子，结果建立了Fndc5基因敲除小鼠模型，由于Fndc5与糖尿病、肥胖疾病密切相关，表明其可用于建立二型糖尿病的小鼠模型。

Establishment of a novel Fndc5 knockout mouse model

The invention discloses a method for establishing a novel Fndc5 gene knockout mouse model, belonging to the pharmacological application field of pathological animal models. The present invention by TALEN technology, the Fndc5 gene DNA sequence frameshift mutation, thus the protein corresponding frameshift mutations, leading to premature termination codon produced results, established the Fndc5 gene knockout mouse model, due to Fndc5 and diabetes, obesity is closely related to that which can be used to establish the animal model of type two diabetes mellitus.

【技术实现步骤摘要】
一种新型Fndc5基因敲除小鼠模型的创建
本专利技术涉及一种新型Fndc5基因敲除小鼠模型的创建，并涉及其在制作糖尿病、肥胖等病理模型的用途，属于病理模型的药理用途领域。
技术介绍
随着饮食结构和生活方式的改变，系统能量稳态失衡，糖尿病发生率逐年增加，已成为倍受关注的公共卫生问题。骨骼肌在调控系统能量稳态上扮演着重要的角色。一方面骨骼肌自身发生物质代谢如糖代谢等调控系统能量稳态；另一方面骨骼肌能分泌肌因子作用于脂肪、肝脏等器官调节系统能量稳态。研究发现Fndc5在运动的刺激下作为PGC1-α依赖的产物，随后裂解产生Irisin进入血液作用于白色脂肪，刺激UCP1表达提高产热；促使白色脂肪棕色化，从而提高和改善了肥胖和糖尿病患者的代谢状态，为治愈肥胖和糖尿病提供了可能，表明Fndc5可以作为药效筛选的新的靶点。本专利技术利用技术创建了Fndc5敲除小鼠动物模型，本专利技术解决了筛选出对该靶点发挥作用药物的问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种新的糖尿病并发症-周围神经病变的大鼠模型。本专利技术的主要目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术将Fndc5-T1和Fndc5-T3的TALEN质粒对，体外转录成mRNA后，共显微注射mRNA到小鼠的受精卵中，一共注射120个受精卵，出生23只小鼠。两周龄后，剪取4周龄出生小鼠任一只耳朵大约三分之一，提取基因组DNA。以此基因组DNA为模板进行PCR反应，将产物进行测序。通过测序图可分析小鼠的突变情况：如果测序峰全是单峰说明该小鼠是WT(野生型)；如果测序峰在预定位置出现双峰且2种峰恰好对应不同的突变类型则该小鼠为Fndc5基因敲出首建鼠(Founder)。根据发生移码突变情况，选取雄性Founder小鼠分别与野生型C57小鼠(♀)交配，出生的小鼠两周龄后按上述方法进行基因型鉴定。通过测序图可分析F1代小鼠的突变情况：如果测序峰全是单峰说明该小鼠是WT(野生型)；如果测序图出现双峰则该小鼠为杂合子；如果测序图也是单峰但是在预期位置出现缺失突变则该小鼠为纯合基因敲除小鼠，建立稳定遗传F1代小鼠品系，从而可以应用于相关药物的药效评价。图1是Fndc5的基因组及蛋白质一级结构图，注：A为Fndc5蛋白质的一级结构，B为Fndc5基因组结构(箭头为TALEN的靶点位置)；图2是Fndc5TALEN的SSA活性检测统计结果图；图3是Fndc5TALEN的SSA活性检测报告图；图4是Fndc5基因敲除首建鼠的鉴定图，注：突变型1的DNA序列(向下箭头所指峰形)和突变型2的DNA序列(向上箭头所指峰形)。下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下，可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实验例1.1材料1.1.1实验动物野生型C57BL/6小鼠品系，购自北京维通利华有限公司，合格证号：SCXK(京)2014-0001。饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房，实验动物使用许可证：SYXK(京)2013-0023，动物房温度20～26℃，相对湿度40～70％。1.1.2TALEN质粒TALEN质粒pCS5-eTALEN-T由北京唯尚立德生物科技有限公司合成。靶位点位置T1：TTTCTAGAAGAAGGATGTgcggatgctccggttCATTCAGGAGGTGAACA，其中左边TALE识别序列：TTCTAGAAGAAGGATGT17bp，右边TALE识别序列：GTTCACCTCCTGAATG16bp，间隔15bp。靶位点位置T3：TCCGGCACCTCAAGGCCaactctgccgtggtcagCTGGGATGTCCTGGAGGA，其中左边TALE识别序列：CCGGCACCTCAAGGCC16bp，右边TALE识别序列：CCTCCAGGACATCCCAG17bp，间隔17bp。1.1.3引物对于靶点位置1，设计基因型检测PCR引物：CATGTTTCCTTAGCTCTACTGTGG(正向)，GGAGAAAGCATGCATGGCAGTCTC(反向)PCR片段长度为518bp；对于靶点位置3，设计基因型检测PCR引物：GGACCCTTGGTTTGGCCAGTCTA(正向)，CTCTACCATCATCCTCCATGCCTG(反向)PCR片段长度为479bp。Real-Time引物：FNDC5-F：ATGAAGGATGGGGAGGAA，FNDC5-R：GCGGCAGAAGAGAGCTATAACA，18s-F：CATGCAGAACCCACGACAGTA，18s-R：CCTCACGCAGCTTGTTGTCTA。1.1.4试剂本实验的引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。AmpPCRmix(TAKARA，Ro74A)试剂盒、TransZolUpPlusRNAKit(Tran，ER501-01)、EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMxi(Tran，AE301-03)、TransStrtTopGreenqPCRSupreMix(Tran，AQ131-02)、Base(碱液)、Neutrlization(中和液)等。1.2方法1.2.1四品系Fndc5基因敲除鼠的构建将Fndc5-T1和Fndc5-T3的TALEN质粒对，体外转录成mRNA后，共显微注射mRNA到小鼠的受精卵中，一共注射120个受精卵，出生23只小鼠。两周龄后，剪取4周龄出生小鼠任一只耳朵大约三分之一，放置在做好标记的1.5ml的离心管中，加入75ul碱液(Base)95℃以上40分钟；然后加入75ul中和液(Neutrlization)，常温静置几分钟，溶液即为提取的基因组DNA。以此基因组DNA为模板进行PCR反应，将产物进行测序。通过测序图可分析小鼠的突变情况：如果测序峰全是单峰说明该小鼠是WT(野生型)；如果测序峰在预定位置出现双峰且2种峰恰好对应不同的突变类型则该小鼠为Fndc5基因敲出首建鼠(Founder)。共有15只小鼠带有突变，其中3只移码：7(T1一条缺失2bp，一条缺失4bp)、Founder13(T1缺失2bp)、Founder18(T1一条缺9bp，一条缺2bp；T3缺2bp)。根据发生移码突变情况，选取雄性Founder7(m-fn-7，♂)小鼠、Founder13(m-fn-13，♂)小鼠、和Founder18(m-fn-18，♂)小鼠分别与野生型C57小鼠(♀)交配，出生的小鼠两周龄后按上述方法进行基因型鉴定。通过测序图可分析F1代小鼠的突变情况：如果测序峰全是单峰说明该小鼠是WT(野生型)；如果测序图出现双峰则该小鼠为杂合子；如果测序图也是单峰但是在预期位置出现缺失突变则该小鼠为纯合基因敲除小鼠。我们从中选出4中突变类型#7-T1-1(T1缺失2个碱基CT)、#7-T1-2(T1缺失4个碱基GCTC)、#13-T1-1(T1缺失2个碱基TG)、#18-T1-1(T1缺失2个碱基TC)建立稳定遗传F1代小鼠品系。2.结果2.1四品系Fndc5基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型Fndc5基因敲除小鼠模型的创建在药效学评价方面的用途。

【技术特征摘要】
1.一种新型Fndc5基因敲除小鼠模型的创建在药效学评价方面的用途。2.Fndc5基因敲除小鼠模型在...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡世焕，金文，吴子环，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11