本发明专利技术涉及一种菠萝蔗糖磷酸合成酶的基因如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１及其编码蛋白质如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：２，属于生物技术领域；本发明专利技术还涉及该基因的克隆方法：提取菠萝果实中的总ＲＮＡ，用琼脂糖凝胶电泳检测该菠萝果实中的总ＲＮＡ，以总ＲＮＡ为摸板，以Ｏｌｉｇｏ?ｄＴ为引物反转录合成第一链ｃＤＮＡ，进行ＰＣＲ扩增、ＰＣＲ产物与ｐＧＥＭ－Ｔ?ｅａｓｙ载体连接，转化，筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经ＰＣＲ进一步验证后测序，获得Ａｃ－ＳＰＳ１基因；本发明专利技术的基因可为从分子水平进行菠萝果实糖积累的机理研究提供理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因及其克隆方法，同时也涉及到基因编码蛋白质，属于生物技术领 域，具体涉及一种菠萝蔗糖磷酸合成酶基因AC-SPS1、其编码蛋白质以及基因克隆方法。
技术介绍
菠萝(Ananas comosus)是凤梨科多年生常绿草本植物，其果实富含多种糖分、有 机酸、矿质元素以及人体必须的多种维生素，营养价值高，深受人们的喜爱。如今菠萝已成 为世界性的重要水果，据FAO统计，2006年世界菠萝产量为1826万吨，是继香蕉和芒果之后 的世界第三大热带水果。我国自17世纪初开始引种菠萝，主要分布在广东、广西、海南、云 南、福建等省区。近年来，我国菠萝产业迅速增长，在世界上仅次于泰国、菲律宾之后的第三 大菠萝生产国。虽然菠萝是我国相对比较有优势的热带果品，但我国菠萝的出口比例较小，国际 和国内市场价格明显偏低，经济效益不高，严重挫伤了果农的生产积极性，阻碍了我国菠萝 产业的进一步健康发展。造成这一结果的原因很多，但品质较差无疑是最主要的原因之一。 因此提高菠萝品质已成为我国菠萝产业今后能否经受住市场冲击，并在竞争中获得长足发 展的关键问题。菠萝果实品质包括外观和内在品质两个方面，而糖分是造成果实品质优劣 的主导因素。因此，研究果实中糖代谢对改善果实的品质具有重要的意义。蔗糖磷酸合成酶(SPS)在蔗糖合成过程起着重要的作用，Huber研究表明，SPS是 合成蔗糖的关键酶之一，SPS活力越高，蔗糖积累得越多(Huber and Huber，1996)，蔗糖磷 酸合成酶活性与淀粉积累呈现负相关，而与蔗糖形成呈正比关系，因此SPS的活力大小直 接影响光合产物在淀粉与蔗糖之间的分配(Huber，1983)。目前编码基因的SPS也已从玉 米、菠菜、马铃薯、甜菜、柑桔、苹果、甘蔗、水稻、甜瓜、巨龙竹等14种植物中克隆得到，多为 3000-3600bp的mRNA片段(吴平等，2000)。Li等(2003)从热带附生植物紫蝴蝶兰中克隆 出SPS基因的全长cDNA来，该cDNA被命名为spsl，长为3820bp，含有3182bp的开放阅读 框，并编码1061个氨基酸，该氨基酸序列与玉米和菠菜的同源性分别为56%和69%。番茄 中克隆得到的SPS基因的全长cDNA，长为3373bp，编码区序列长为3162bp，编码1054个氨 基酸(孙丽萍等，2005)。Komatsu等(1996)在柑橘中克隆到了 3个编码SPS的cDNA同工 型片段，分别命名为CitSPSl、CUSPS2和CUSPS3，随后用CitSPSl和果实的cDNA文库杂 交获得了一个全长3539bp的cDNA-CitSPSl。此cDNA编码1个含1057个氨基酸、分子量为 117. 8kD的多肽链，与小麦和菠菜SPS的同源性分别为55. 8%和74. 0%，含有磷酸化位点 Ser15°，与钙调素依赖蛋白激酶II(CaM-d印endent protein kinase II)和磷酸化激酶位点 (Argl47-Ile-Ser-Ser-Vall51)的共同序列RXXSV匹配，而且磷酸化丝氨酸在C-端有酸性 残基(Aspl52, Glul55)，这在酪蛋白激酶II位点上也有(Komatsu等，1996)。在菠菜和甜 菜(Hesse等，1995)中克隆得到的SPS cDNA也有这些特异位点和结构。但目前还没有关于菠萝果实蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的相关报道，因此，对菠3萝蔗糖磷酸合成酶基因的克隆以及对他们的生物学功能研究，将有助于明确菠萝果实糖代 谢的分子机理，为调控果实品质等研究奠定基础。
技术实现思路
鉴于上述问题，本专利技术的主要目的在于提供一种首次从菠萝果实中获得的菠萝果 实蔗糖磷酸合成酶基因。本专利技术的另一个目的是提供菠萝蔗糖磷酸合成酶编码的氨基酸序列及编码蛋白 性质的生物信息学预测。同时，本专利技术还提供该菠萝蔗糖磷酸合成酶基因的克隆方法。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的本专利技术所提供的菠萝蔗糖磷酸合成酶，从菠萝(Ananas comosus)中克隆，命名为 Ac-SPSl基因，核苷酸序列如SEQ ID NO :1。上述菠萝蔗糖磷酸合成酶编码的蛋白质，命名为Ac-SPSl蛋白质，其氨基酸序列 如 SEQ IDNO :2ο上述菠萝蔗糖磷酸合成酶基因Ac-SPSl的克隆方法，包括如下步骤(1)选用菠萝果实作为实验材料，采用改良SDS法提取菠萝果实中的总RNA，RNA含 量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；(2)采用Takara公司生产的mRNA Selective PCR Kit Ver 1. 1 二步法进行反转录 获得cDNA ；(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计菠萝Ac-SPSl基因编码区引物正向引物5，-GGA(G/A) CTTGG (T/A/G/C) CG (T/G) GATTCTGATA-3，反向引物5，-CAGGAAC(A/T/C) TC (A/T) GA (C/T) TG (C/T) TTGTG-3，反应体系为10XPCRBuffer II 2. 5 μ l,25mM MgCl2 1. 5μ IUOmM dNTP/ analog Mixturel μ 1、ExTaq 0. 2μ1、10μ1 cDNA 样品、正向引物(20 μ Μ) 1 μ 1、反向引物 (20 μ Μ) 1 μ 1、再补足Rnase Free H2O至总体积25 μ 1 ；扩增程序为85°C变性lmin_52°C复 性lmin-72°C延伸2min，28个循环后，72°C延伸IOmin ；(4)PCR产物回收后与pGEM-T easy Vector连接，连接产物转化Ε· coli DH 5 α 感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得 Ac-SPSl 基因。本专利技术的Ac-SPSl基因扩增片段大小为1133bp，其编码376个氨基酸，含有典型的 糖基转移酶结构域。经同源序列比较发现，所克隆的菠萝Ac-SPSl基因的氨基酸序列中包 含了 SPS蛋白家族的两个丝氨酸保守结构域，一个为14-3-3蛋白特异结合位点，另一个是 渗透胁迫的激活位点，它们可被相应的蛋白激酶或磷酸酶分别磷酸化或脱磷酸化而改变酶 活性，也可与14-3-3蛋白特异结合改变酶活性。本专利技术的有益效果是本专利技术对菠萝蔗糖磷酸合成酶基因的克隆以及对他们的生物学功能研究，将有助 于明确菠萝果实糖代谢的分子机理，为调控果实品质等研究奠定基础，为改善菠萝果实的 品质做出积极地贡献。具体实施例方式下面结合具体实例对本专利技术做进一步详细的描述，这些实施例只用来说明本发 明，并不限制本专利技术的范围。实例1菠萝蔗糖磷酸合成酶基因Ac-SPSl的分子克隆选用巴厘菠萝果实作为实验材料，提取果肉中的总RNA。以获得的总RNA为摸板， 反转录合成cDNA。根据NCBI数据库中的EST信息设计菠萝Ac-SPSl基因编码区引物正 向引物5，-GGA(G/A)CTTGG(T/A/G/C)CG(T/G)GATTCTGATA-3，，反向引物5，-CAGGA AC(A/ T/C) TC (A/T) GA (C/T) TG (C/T) TTGTG-3，。采用 Takara 的 Ex-Taq 酶进行 PCR 扩增，PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种菠萝果实蔗糖磷酸合成酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜丽清，张秀梅，孙光明，谢江辉，姚艳丽，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：44
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