来源于酵母的新型细胞壁锚定蛋白及其基因和使用其的细胞表面表达系统技术方案

本发明专利技术提供了衍生自酵母的新的细胞壁锚定蛋白，其基因以及使用其粘连多肽到酵母细胞壁的遗传方法。尤其是，本发明专利技术提供了新型的ＧＰＩ（糖基磷脂酰肌醇）－锚定蛋白基因，ＳＥＤ１，ＧＡＳ１，ＴＩＰ１，和ＣＷＰ１，及其蛋白质，ＰＩＲ２细胞壁蛋白基因及其蛋白质，其衍生于多形汉逊酵母，以及使用它们将外源的酶或者多肽固定到微生物细胞的细胞壁的细胞表面表达系统。此外，本发明专利技术提供了细胞表面表达系统，其使用衍生自包括多形汉逊酵母和酿酒酵母的酵母ＷＳＣ１基因及其蛋白，和衍生自Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ的ＳＴＡ１基因及其蛋白。本发明专利技术的细胞表面表达系统可以通过粘连所需的蛋白到该细胞表面起到生物催化剂的固定作用，并且提供一种通过文库筛选改变靶蛋白特征如结合亲和性和稳定性的手段。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及来源于酵母的新型细胞壁锚定蛋白及其基因和使用其的表面表达系统。更具体地说，本专利技术涉及使用四种来源于多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的GPI(糖基磷脂酰肌醇)-锚定蛋白，HpSed1p，HpGas1p，HpTip1p和HpCwp1p，及来源于多形汉逊酵母的细胞壁蛋白HpPir2p在多形汉逊酵母和其他酵母的细胞表面表达外源蛋白的表面表达系统。另外，本专利技术涉及使用来源于多形汉逊酵母的HpWSC1和来源于Saccharomyces diastaticus的STA1编码的蛋白在多形汉逊酵母和其他酵母的细胞壁表面表达外源蛋白的表面表达系统。 专利技术的
技术介绍
由于在细胞表面表达蛋白具有多种用途，如包括生产新型疫苗、筛选各种抗原和抗体、在细胞表面固定化有用的酶类等。因此，近年来，对在单细胞生物，如噬菌体、细菌和酵母表面表达期望得到的蛋白进行了活跃的研究。首先，在细胞表面表达外源蛋白应用于筛选抗原决定簇和抗原性决定多肽片段，并以疫苗的稳定生产为目的。在此之前，是通过从随机突变病原体库中筛选具有稳定连续滴度的突变体来生产疫苗的。但是以这种传统方式生产的疫苗在对人或动物口腔途径给药时可能会丢失抗原性。已进行了很多努力来克服这些问题，如使用细胞表面展示的活性口腔疫苗。在细胞表面表达抗原蛋白的策略中，内源性细胞表面蛋白是用来指导这些蛋白表达在细胞表面的。例如，将编码细胞表面蛋白的基因与编码抗原蛋白的基因融合，然后将得到的重组基因导入革兰氏阴性细菌中，从而在细胞表面表达融合蛋白。这种以融合蛋白作为介体的抗原蛋白可作为有效抗原引发免疫反应。特别是由于存在于革兰氏阴性细菌细胞膜上的脂多糖(LPS)可以增强这种表达在细胞表面的融合蛋白的抗原性，所以革兰氏阴性细菌非常适于实现上述目的。通常分泌或表达在细胞表面的蛋白在其一级序列上带有分泌信号，以使新生蛋白穿过细胞质膜。为了在革兰氏阴性细菌细胞表面表达，蛋白需跨过细胞质膜和周质空间，然后插入外膜中以穿过外膜。在细菌中，有几种酶和毒素具有分泌信号和(或)指导蛋白定位的定位信号。因此，利用这些分泌信号或定位信号，并带有合适的启动子，可以成功地实现外源蛋白在细胞表面的定位。迄今为止，已对利用革兰氏阴性细菌的表面蛋白在细胞表面表达外源蛋白进行了广泛尝试。用于外源蛋白定位的表面蛋白主要分为外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白和细胞表面器官蛋白。革兰氏阴性细菌中已知的外膜蛋白LamB，PhoE和OmpA已用于在细胞表面生产外源蛋白。当使用外膜蛋白时，由于外源蛋白必须嵌入伸出细胞表面的环中，因此外源蛋白的大小会受到限制。而且由于嵌入的外源蛋白C和N末端需要在三维结构上彼此紧邻，因此如果二末端的距离相距很大时，需用连接肽将其拉在一起。实际上，在使用LamB或PhoE时，当嵌入的外源多肽大于等于50-60个氨基酸，则由于位阻效应很难构建成稳定的膜蛋白。(Charbit等，J.Immunol.，1997，139，1658-1664；Agterberg等，Vaccine，1990，8，85-91)。为了解决这个问题，尝试使用了正确定位所必须的最小的定位信号OmpA片段。例如，成功地在细胞表面表达了连接在OmpA C末端的β-内酰氨酶。蛋白从细胞质到外膜的转移由融合在OmpA N末端大肠杆菌脂蛋白Lpp的信号序列来完成。(Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，489，2713-2717)。如上所述，用细菌外膜蛋白在细胞表面展示外源蛋白需要在基因水平上将外源蛋白与合适的外膜蛋白连接起来，从而形成可穿过细胞质膜的融合蛋白，并能够稳定地插入到外膜中。合适的表面锚定基序是满足以下要求的外膜蛋白1)具有一个分泌信号，允许融合蛋白穿过细胞质膜；2)具有一个定位信号，允许融合蛋白锚定在外膜里；3)在外膜大量表达；和4)与蛋白大小无关，可稳定表达。迄今为止，还没有找到满足以上所有要求的表面定位基序。与此同时，脂蛋白也已用作表面定位基序。特别是来源于大肠杆菌的脂蛋白非常有用，因为它可通过N末端分泌信号穿过内膜，并通过其末端的L-半胱氨酸以共价键直接与外膜或内膜的脂类连接。来源于大肠杆菌的脂蛋白Lpp，其N末端与外膜相连，而C末端与细胞壁肽聚糖相连，因此它与外膜蛋白A融合后可用于在大肠杆菌表面分泌和转运外源蛋白。(OmpA，Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，489，2713-2717)。另一个用于外源蛋白表面表达的脂蛋白是TraT。据报道，TraT已用于在大肠杆菌表面表达多肽，如脊髓灰质炎病毒C3抗原决定簇(Felici等，J.Mol.Biol.，1991，222，301-310)。另外，虽然与肽聚糖连接的脂蛋白(PAL)其功能还没有阐述清楚，但已用于重组抗体的表面表达(Fuchs等，Bio/Technology，1991，9，1369-1372)。在这种情况下，PAL的C末端与肽聚糖相连，而N末端与暴露在细胞表面的重组抗体融合。能够穿过外膜的分泌蛋白也可用作表面锚定基序，但在革兰氏阴性细菌中没有得到很好的发展。只有一些蛋白在辅助蛋白的帮助下具有分泌机制。例如，Klebsiella oxytoca分泌的脂蛋白--普鲁兰酶通过脂类与其N末端连接锚定在外膜上，而且在生长稳定期完全分泌到培养基中。Komacker等试图利用普鲁兰酶N末端片段在细胞表面表达β-内酰氨酶，但表达的普鲁兰酶-β-内酰氨酶融合蛋白在短期的锚定后又释放到细胞培养基中。当使用周质空间蛋白--碱性磷酸酶作为定位蛋白时，则不能实现表面表达。因为碱性磷酸酶的分泌至少需要14个蛋白才能够实现，所以它的功能表达是很困难的。(Komacker等，Mol.Microl.，1990，4，1101-1109)。Neisseria是一种具有一个非常有趣的分泌系统的病原微生物，来源于该菌的IgA蛋白酶C末端的β-结构域具有分泌信号，该信号指导N末端蛋白酶结构域分泌到细胞表面。该蛋白酶在锚定到外膜上后又通过自身的催化水解分泌到培养基中。12kDa的霍乱毒素B亚基已利用IgA蛋白酶的β-亚基进行了表面表达。(Klauser等，EMBO J.，1990，9，1991-1999)。但由于在转移过程中发生蛋白折叠，从而阻止了融合蛋白的分泌。来源于革兰氏阴性细菌细胞表面器官的蛋白，如鞭毛、菌毛和纤毛蛋白，也可用作表面锚定基序。例如，鞭毛丝的亚基蛋白--鞭毛蛋白已用于进行霍乱毒素B亚基和B型肝炎病毒多肽的稳定表面表达，这些表达的蛋白可与其相应抗体进行强烈反应(Newton等，Science，1989，244，70-72)。当使用纤毛亚基蛋白--纤毛蛋白时，只能对小分子肽进行成功表达(Hedegaard等，Gene，1980，85，115-124)。已尝试用革兰氏阳性和阴性细菌的表面蛋白作为表面锚定基序，在革兰氏阳性细菌中进行表面表达(Samuelson等，J.Bacterial.，1995，177，1470-1476)。包含80个氨基酸残基的疟疾红内期抗原和来源于Streptococcus并与白蛋白相连的蛋白G在革兰氏阳性细菌细胞表面得到有效表达，所使用的表面表达系统包括由本文档来自技高网...

【技术保护点】
来源于多形汉逊酵母的由ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１表示的新型细胞壁蛋白基因ＨｐＳＥＤ１及其同系物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔毅星，孙廷薰，金素影，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]