一种在微通道内固定化蛋白质的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种在微通道内固定化蛋白质的方法，包含下列步骤：步骤一，MagR与目标蛋白质的融合重组表达；步骤二，含有融合重组蛋白质的液体在处于磁场中的微通道内时，目标蛋白质固定化在微通道内壁上；步骤三，使用过程中，从微通道内壁脱离的融合重组蛋白，在微通道末端出口被强磁场吸附回收；步骤四，所固定的蛋白质在使用完毕后，通过流体冲洗，清除所固定化的蛋白质；步骤五，清除所固定化的蛋白质后，重复步骤二至步骤四，实现在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。本发明专利技术还提供了这种方法的应用领域。本发明专利技术的优点是：操作简便，成本低廉；适用于不同材质的微通道内表面。

Method and application for immobilizing protein in micro channel

The invention relates to a method for immobilizing protein in the micro channel, comprising the following steps: step one, the expression of MagR and target protein fusion; step two, containing the fusion recombinant protein liquid in the micro channel in a magnetic field when the target protein is immobilized in the microchannel wall; step three, use the in the process, from the micro channel wall from the recombinant fusion proteins, in the micro channel end by the strong magnetic field adsorption; step four, the fixed protein after use, through fluid flushing, protein removal of the immobilized; step five, removal of the immobilized protein, repeat steps two to step four, to achieve in the micro channel repeat protein \immobilized using scavenging - re fixed operation. The invention also provides the application field of the method. The invention has the advantages of simple operation and low cost; the utility model is suitable for the inner surface of micro channels of different materials.

【技术实现步骤摘要】
一种在微通道内固定化蛋白质的方法及应用
本专利技术属于生物化工技术和分析检测领域，具体涉及一种在微通道内固定化蛋白质的方法及应用。技术背景微通道(microchannel)是微反应器、检测器、微流混合器、微流传感器等设备的核心精密组件结构，广泛用于化学品的生产、材料的合成、物质的超细粉碎或乳化、物料的快速混合、信号的发生、探测与控制、化学或生物物质的检测和分析等。在许多情况下，需要蛋白质能够稳定固定于微通道的内表面。然而在微通道内表面固定蛋白质往往是一件费时费力且成本高昂的工作，目前除了在一些贵重分析检测设备中有少量应用外，在实际应用中并不多见。借鉴于传统的蛋白质固定技术，对于在微通道表面固定化蛋白质已经有了多种多样的尝试，例如共价交联，表面功能化处理以吸附或捕捉目标蛋白，以及简单的物理吸附，等等。鉴于蛋白质具有一定的寿命，并不适于长时间使用，因此固定化蛋白质的微通道在功能上也随所固定的蛋白质一样具有同等且较短的寿命，由于生产价格较为昂贵，从生产成本上考虑，微通道需要长久重复使用，这就要求蛋白质在微通道内表面的固定化具有以下技术特点：1-操作简便，成本低廉；2-易于在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。此外，由于制造微通道的材料可以多种多样，这就要求理想的蛋白质固定化技术也必须适用于不同材质的微通道内表面。基于上述要求，一般来讲共价交联并不便于所固定蛋白质的清除和多次重复固定化，且该技术需要功能化微通道内表面，使其能与蛋白质共价交联，适用材质的范围窄且操作成本高。而通过内表达的功能化的处理来吸附固定化蛋白质的方法，也具有类似缺陷，一方面微通道的选材往往多种多样，内表面的功能化处理技术往往适用性差，另一方面内表面的功能化成本较高且由于表面功能层也具有一定的寿命而不适于蛋白质的多次重复固定化。相比于前两种，在微通道内表面通过简单的物理吸附作用来固定化蛋白质将是一种理想的技术，但其前提是要满足下述三个要求，即1-操作简便，成本低廉；2-易于在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；3-适用于不同材质的微通道内表面。然而到目前为止，可以同时满足上述要求的实用技术却没有报道。基于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种在微通道内表面固定化蛋白质的方法，该方法可满足三个要求，即1-操作简便，成本低廉；2-易于在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；3-适用于不同材质的微通道内表面。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种在微通道内固定化蛋白质的方法，包含下列步骤：步骤一，MagR与目标蛋白质的融合重组表达；步骤二，含有融合重组蛋白质的液体在处于磁场中的微通道内时，目标蛋白质固定化在微通道内壁上；步骤三，使用过程中，从微通道内壁脱离的融合重组蛋白，在微通道末端出口被强磁场吸附回收；步骤四，所固定的蛋白质在使用完毕后，通过流体冲洗，清除所固定化的蛋白质；步骤五，清除所固定化的蛋白质后，重复步骤二至步骤四，实现在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。进一步地，所述MagR是如下蛋白质(i)或(ii)或(iii)：(i)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的氨基酸序列同源；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代，缺失或者叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质；(iii)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所编码蛋白的功能相同的蛋白质。进一步地，步骤一中所述MagR与目标蛋白质的融合重组，为MagR的C端与目标蛋白质的N端融合，或目标蛋白质的C端与MagR的N端融合。可选地，步骤一中所述MagR与目标蛋白质的融合重组，为MagR的C端通过一段连接肽与目标蛋白质的N端融合，或目标蛋白质的C端通过一段连接肽与MagR的N端融合。进一步地，步骤一中所述MagR与目标蛋白质的融合重组表达，以原核微生物、真核微生物或动物细胞昆虫细胞为宿主。进一步地，步骤一中所述MagR与目标蛋白质的融合重组表达，在宿主细胞内表达或细胞外分泌表达。进一步地，步骤二中所述含有融合重组蛋白质的液体是指：MagR与目标蛋白质的融合重组表达后，如果是在宿主细胞内表达的，则通过破壁，来释放与MagR重组的目标蛋白，破壁液的上清即为含有融合重组蛋白的液体；如果是在宿主细胞外分泌表达的，则直接取上清液，即含有融合重组蛋白的液体。进一步地，步骤二中的磁场由外加磁场产生，或者由铁磁体内壁产生。进一步地，所述外加磁场是指在微通道外施加永磁体或电磁体所产生的磁场。进一步地，所述铁磁体内壁是指微通道设备的微通道内壁是铁磁体材料制成，具有铁磁性。进一步地，通过在具有铁磁性内壁的微通道外施加永磁体或电磁体所产生的磁场，来增强目标蛋白在微通道内壁固定化的强度。进一步地，步骤三中，所述强磁场由强磁模块产生，所述强磁模块由永磁体或电磁体构成。进一步地，步骤四中，对于通过外加磁场实现的蛋白质固定化，通过撤除磁场，在微通道内壁为非铁磁体的情况下，直接通过水或其他溶剂等流体冲洗，即可清除所固定化的蛋白质；在微通道内壁为铁磁体的情况下，通过添加蛋白酶的流体冲洗微通道，可清除所固定化的蛋白质。本专利技术的目的之一是提供一种在微通道内表面固定化蛋白质的应用，所述固定化蛋白质应用于微通道反应器的酶催化反应、微流传感器芯片的分析检测等领域。本专利技术的原理根基于一种动物来源的磁受体蛋白MagR棒状复合体的对铁磁体材质及磁力的强相互作用而实现。与现有技术相比，本专利技术具有明显优点，即可同时满足以下要求：1)操作简便，成本低廉；2)易于在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；3)适用于不同材质的微通道内表面。附图说明图1为果蝇MagR的氨基酸编码序列SEQIDNO:1。图2为鸽子MagR的氨基酸编码序列SEQIDNO:2。图3为果蝇磁受体dMagR与红色荧光蛋白的重组融合方式与融合蛋白的磁性吸附。图4为鸽子磁受体clMagR与绿色荧光蛋白的重组融合方式与融合蛋白的磁性吸附。图5为MagR与荧光蛋白分别在枯草芽孢杆菌(a)、里氏木霉(b)和CHO细胞(c)中表达的粗蛋白被磁铁的吸附聚集。图6为重组MagR-蛋白分子在外加磁场微通道(微通道内壁为非铁磁材料)上的固定化及洗脱示意图。图7为重组MagR-蛋白分子在外加磁场微通道(微通道内壁为铁磁材料)上的固定化及洗脱示意图。图8为微通道固定化酶催化反应示意图。图9为微通道中的酶联免疫分析，其中第一(一级)抗体被固定化在微通道芯片的微通道表面。其中，图6a-蛋白分子溶液流向外加磁场的微通道；图6b-蛋白分子被磁场吸附在微通道内壁上，其中2级磁场捕获吸附1级磁场未吸附完全的蛋白分子；图6c-底物分子流经微通道，与蛋白分子发生作用(可为酶催化反应，或者也可为抗体-抗原作用)；图6d-产物流出微通道；图6e-解除外加磁场，蛋白分子从微通道内壁上释放出来，去固定化；图6f-蛋白分子随清洗液流出微通道；图7a-蛋白分子溶液流向外加磁场的微通道；图7b-蛋白分子吸附在铁磁微通道内壁上，其中2级磁场捕获吸附1级磁场未吸附完全的蛋白分子；图7c-底物分子流经微通道，与蛋白分子发生作用(可为酶催化反应，或者也可为抗体-抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在微通道内固定化蛋白质的方法，其特征在于，包含下列步骤：步骤一，MagR与目标蛋白质的融合重组表达；步骤二，含有融合重组蛋白质的液体在处于磁场中的微通道内时，目标蛋白质固定化在微通道内壁上；步骤三，使用过程中，从微通道内壁脱离的融合重组蛋白，在微通道末端出口被强磁场吸附回收；步骤四，所固定的蛋白质在使用完毕后，通过流体冲洗，清除所固定化的蛋白质；步骤五，清除所固定化的蛋白质后，重复步骤二至步骤四，实现在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。

【技术特征摘要】
1.一种在微通道内固定化蛋白质的方法，其特征在于，包含下列步骤：步骤一，MagR与目标蛋白质的融合重组表达；步骤二，含有融合重组蛋白质的液体在处于磁场中的微通道内时，目标蛋白质固定化在微通道内壁上；步骤三，使用过程中，从微通道内壁脱离的融合重组蛋白，在微通道末端出口被强磁场吸附回收；步骤四，所固定的蛋白质在使用完毕后，通过流体冲洗，清除所固定化的蛋白质；步骤五，清除所固定化的蛋白质后，重复步骤二至步骤四，实现在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MagR是如下蛋白质(i)或(ii)或(iii)：(i)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的氨基酸序列同源；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代，缺失或者叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质；(iii)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所编码蛋白的功能相同的蛋白质。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述MagR与目标蛋白质的融合重组，为MagR的C端与目标蛋白质的N端融合，或目标蛋白质的C端与MagR的N端融合。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述MagR与目标蛋白质的融合重组，为MagR的C端通过一段连接肽与目标蛋白质的N端融合，或目标蛋白质的C端通过一段连接肽与MagR的N端融合。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述MagR与目标蛋白质的融合重组表达，以原核微生物、真核微生物或动物细胞为宿主。6.如权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈连红，
申请(专利权)人：理星天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12