一种基于表面等离子体共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法技术

本发明专利技术提供了一种基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法，该方法通过建立用于蛋白质固定的模型，根据模型来优化芯片表面的化学修饰，控制活性位点之间的距离，从而能够在表面等离子共振成像生物传感器芯片上固定蛋白质。通过本发明专利技术的方法保证了蛋白质的单点固定，从而避免了因蛋白质被多点固定而导致的失活，并且通过表面等离子共振成像技术确认了通过此方法固定蛋白质能够获得优化的检测信号。

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面等离子体共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法
本专利技术属于蛋白质芯片阵列领域，涉及一种基于表面等离子体共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法。
技术介绍
在免疫检测领域，包被抗体(一抗)的定向排列引起了广泛的兴趣和关注。在传统检测中，包被抗体被动地吸附在基底(通常是热塑性聚合物，例如聚苯乙烯)表面，使得仅仅20～30％的包被抗体获得了理想的取向而拥有检测活性。在典型的免疫检测中，对包被抗体的非有效固定问题一直少有关注。通常包被抗体被过量地固定在固相表面，以保证有足够多的抗体吸附在表面时具有合适的取向，用以产生可靠的检测信号。然而，当扩展到微米或纳米层面的应用时，固定在表面的抗体需要将一定浓度的Fc端暴露在外面来保证获得足够的检测信号，此时包被抗体错误的取向固定会产生更大的问题。直接取向固定包被抗体是提升检测性能的有效手段，据WilsonDS和KnockS报道，通过直接取向固定包被抗体使信号提高可达10倍，这在微纳米层面的应用中体现更为突出。将抗体固定在基底表面有多种方法，包括吸附固定、共价固定和亲和固定，对于取向固定抗体也有一些相应的技术。目前，大多数直接固定抗体的工作主要集中在抗体Fc端的化学修饰以及其他化学修饰方法，这些方法都可以提高固定抗体的有效活性。然而，特定基团固定的策略，尤其是由于固定使抗体变性，或当抗体的Fab段由于固定的取向被埋藏，可能导致抗体生物活性的丧失。对于商业化治疗性抗体的质量控制来说，最好有一种无标记或者对抗体没有预先化学修饰的技术进行检测。在这类案例当中，过去报道过的取向固定方法由于必须在固定抗体之前进行化学改性，带来一些不便。另一方面，随机共价固定的方式对某些商业化的治疗性抗体有时也可能无效，原因是被固定的基团很有可能在抗体的结合位点附近，而且这些抗体更有可能在表面上被多点固定，从而导致抗体失活。因此，在本领域需要开发一种能够单点固定蛋白质并获得较优化的检测信号的蛋白质固定方法。
技术实现思路
针对现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于表面等离子体共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法，所述方法包括以下步骤：(1)建立用于蛋白质固定的模型；(2)根据所述模型优化芯片表面的化学修饰；(3)在芯片上固定蛋白质；(4)利用表面等离子共振成像来检测固定的蛋白质的信号。本专利技术所述基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法中步骤(1)所述用于蛋白质固定的模型为：其中l为硫醇直径，r为活性末端之间的平均距离，DF为活性末端硫醇溶液被同浓度非活性末端硫醇溶液稀释的倍数；所述用于蛋白质固定的模型的推导过程如下：A＝a*DF(I)考虑a≈l2并且代入式(I)得到：A＝l2*DF(II)考虑活性末端硫醇在有效区域的中心，有效区域假设为正方形，所以r可以如下计算：将式(II)代入式(III)得出所述模型，其中a为硫醇面积，A为平均一个活性末端硫醇分子所占的有效面积。本专利技术所述基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法中步骤(2)所述优化芯片表面的化学修饰包括以下步骤：(A)根据所述模型确定活性末端硫醇溶液被同浓度非活性末端硫醇溶液稀释的倍数DF；(B)清洗芯片，氮气吹干，放入等离子体清洗仪中清洗3分钟；(C)配制混合硫醇溶液：将活性末端硫醇溶液用同浓度非活性末端硫醇溶液稀释DF倍，制成混合硫醇溶液；(D)将芯片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4℃恒温孵育过夜，取出芯片，清洗芯片表面，氮气吹干，备用。本专利技术所述活性末端硫醇为一端带有活性基团的有机硫醇化合物，活性末端可以是羧基、醛基、酰基、环氧基、氰基、卤代烃基、酯基等便于进行化学修饰的基团。在本专利技术中所述活性末端硫醇与非活性末端硫醇是一对相互对应的概念，其中所述活性与非活性是相对于硫醇末端进行化学修饰时要连接的物质而言的，例如，如果待连接的物质是蛋白质，则硫醇末端可与蛋白质的氨基反应的定义为活性末端硫醇，硫醇末端不能与蛋白质的氨基反应的定义为非活性末端硫醇，例如此时可将羧基末端硫醇称为活性末端硫醇，而将烷氧基末端硫醇称为非活性末端硫醇；再如，对于复杂的芯片表面三维修饰，要在二维修饰基础上再次进行修饰，此时所利用的例如硫醇引发剂末端可能带有卤代烃基引发端，此时将卤代烃基末端硫醇称为活性末端硫醇，而可利用不与修饰物基团反应的羟基末端硫醇为非活性末端硫醇，但是如果待连接的物质是可以与羟基反应达到化学修饰目的时，羟基末端硫醇则被称为活性末端硫醇。在本专利技术中所述活性末端硫醇可以为但不限于羧基末端硫醇、醛基末端硫醇、酰基末端硫醇、环氧基末端硫醇、卤代烃基末端硫醇、氰基末端硫醇和酯基末端硫醇中的任意一种；本专利技术所述非活性末端硫醇可以为但不限于烷基末端硫醇、烷氧基末端硫醇和羟基末端硫醇中的任意一种。在本专利技术方法的步骤(2)所述优化芯片表面的化学修饰的步骤(B)和步骤(D)中在氮气吹干前所述清洗芯片独立地为用乙醇和去离子水交替清洗。本专利技术方法的步骤(2)所述优化芯片表面的化学修饰包括优化芯片表面的二维化学修饰和/或三维化学修饰。芯片表面的二维化学修饰是指在芯片表面用直链化学修饰物进行修饰，从而在芯片表面形成二维化学结构；所述三维化学修饰是指利用支化或超支化化学修饰物(如支化或超支化聚合物)来修饰芯片表面，或者在芯片表面形成二维化学结构之后，利用二维化学结构的活性末端再与支化或超支化化学修饰物反应，使表面形成支化或超支化的三维化学结构。本专利技术所述基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法中步骤(3)所述在芯片上固定蛋白质包括以下步骤：(a)将表面化学修饰优化的芯片浸入芯片表面上活性末端的活化试剂的溶液中活化；(b)用去离子水清洗芯片，氮气吹干，将目标蛋白质溶液在芯片表面打印形成蛋白质阵列；(c)用2％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在室温下封闭20分钟，完成芯片上蛋白质的固定。本专利技术所述在芯片上固定蛋白质的步骤(a)中所述芯片表面上活性末端的活化试剂是指能够使经修饰的芯片表面的活性末端活化的试剂，在本专利技术中该活化试剂可以根据活性末端基团的不同选择1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.4M/0.1M)混合溶液或者N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液。在本专利技术所述在芯片上固定蛋白质的步骤(b)中所述将目标蛋白质溶液在芯片表面打印为手动点样或利用蛋白质打印机进行。本专利技术所述在芯片上固定蛋白质不局限于在芯片上固定一种蛋白质，还可以在第一种蛋白质固定之后，通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用将第二种或两种以上的其他蛋白质固定在芯片上，例如，可以先将链霉亲和素固定在芯片上，而后通过链霉亲和素与生物素标记蛋白之间的特异结合将生物素标记蛋白固定在芯片上。本专利技术所述基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法中步骤(4)所述利用表面等离子体共振成像(SPRi)来检测固定蛋白质的信号包括以下步骤：清洗表面打印有蛋白质阵列的芯片，吹干后装入表面等离子体共振成像仪，向系统中加入缓冲溶液，调整光学位置以选定点本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)建立用于蛋白质固定的模型；(2)根据所述模型优化芯片表面的化学修饰；(3)在芯片上固定蛋白质；(4)利用表面等离子共振成像来检测固定的蛋白质的信号。

【技术特征摘要】
1.一种基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)建立用于蛋白质固定的模型；(2)根据所述模型优化芯片表面的化学修饰；(3)在芯片上固定蛋白质；(4)利用表面等离子共振成像来检测固定的蛋白质的信号；步骤(1)所述用于蛋白质固定的模型为：其中l为硫醇直径，r为活性末端之间的平均距离，DF为活性末端硫醇溶液被同浓度非活性末端硫醇溶液稀释的倍数；所述用于蛋白质固定的模型的推导过程如下：A＝a*DF(I)考虑a≈l2并且代入式(I)得到：A＝l2*DF(II)考虑活性末端硫醇在有效区域的中心，有效区域假设为正方形，所以r可以如下计算：将式(II)代入式(III)得出所述模型，其中a为硫醇面积，A为平均一个活性末端硫醇分子所占的有效面积。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述优化芯片表面的化学修饰包括以下步骤：(A)根据所述模型确定活性末端硫醇溶液被同浓度非活性末端硫醇溶液稀释的倍数DF；(B)清洗芯片，氮气吹干，放入等离子体清洗仪中清洗3分钟；(C)配制混合硫醇溶液：将活性末端硫醇溶液用同浓度非活性末端硫醇溶液稀释DF倍，制成混合硫醇溶液；(D)将芯片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4℃恒温孵育过夜，取出芯片，清洗芯片表面，氮气吹干，备用。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性末端硫醇为羧基末端硫醇、醛基末端硫醇、酰基末端硫醇、环氧基末端硫醇、卤代烃基末端硫醇、氰基末端硫醇或酯基末端硫醇中的任意一种。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非活性末端硫醇为烷基末端硫醇、烷氧基末端硫醇和羟基末端硫醇中的任意一种。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(B)和步骤(D)中在氮气吹干...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱劲松，哈维尔·巴蒂斯塔·佩雷斯，杨墨，迪彭德拉·特亚吉，埃内斯托·莫雷诺，洛尼·卡尔沃，程志强，李少鹏，周文菲，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11