制备α－１－抗胰蛋白酶溶液的方法技术

从含Ａ１ＡＴ的溶液中制备Ａ１ＡＴ的方法，包括以下步骤：（ａ）将含Ａ１ＡＴ的溶液进行离子交换层析；（ｂ）加去污剂和任选的溶剂来灭活脂质囊膜病毒；（ｃ）随后增加盐浓度使去污剂盐析。Ａ１ＡＴ纯度＞９０％，活性形式的活性≥０．８ＰＥＵ／ｍｇ。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备含α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)的溶液的方法，并涉及A1AT。A1AT是分子量约55,000道尔顿的糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。A1AT可抑制多种蛋白酶如胰蛋白酶的活性，该抑制剂的名字基于胰蛋白酶是由于历史原因。生理上，弹性蛋白酶是靶蛋白酶，参与尤其是组织与基质重构和降解过程，并由细胞如颗粒细胞释放并因此参与炎症过程。弹性蛋白酶活性的持续时间在时间和空间上受到抑制剂A1AT限制并基本受其调节。这种活性的失调导致组织迅速降解并可以有病理生理后果。此外，启动和/或促进炎症过程。弹性蛋白酶控制减少或缺乏的已知实例是伴随炎症现象的肺中的进行性局部组织降解，这进行性地导致肺气肿并因而伴随部分显著的肺功能限制。最后阶段，这可以导致患者死亡，这只能最终通过肺移植来阻止。这些患者受缺乏A1AT或A1AT功能受限的痛苦。正常情况下该抑制剂由肝较大量的生成并分泌，并在血浆中以较高浓度(典型浓度是1.3mg/ml)循环。此外，生理有效的并且足够浓度的A1AT发现于健康人的一些器官，尤其是肺液(上皮层液)中。如果该A1AT浓度显著降低或如果存在的A1AT的功能受限制或无活性(灭活)，则肺组织不受控制的变性并具有上述后果。缺乏A1AT或A1AT抑制功能降低的原因主要是遗传缺陷。所谓的“Z”突变，尤其是纯合(PiZZ)个体中的“Z”突变导致已经存在于合成A1AT分子的细胞中的这些分子聚合。因此，A1AT不再能进入循环，或只有极少量进入循环。一方面，这导致缺乏抑制活性，经一段持续时间后在肺中尤其明显；另一方面，导致肝细胞中富集其聚合物，从而导致相应的功能性疾病。杂合PiZ个体的抑制能力相应降低。已知还有具有相似缺陷的其它突变。根据目前估计，PiZZ突变在美国的发生率为人群中1/1600的水平；因此，突变携带者的数目明显更高，可能只验明了其中的10％。基于A1AT缺陷或A1AT功能减退的肺功能性疾病(进行性肺气肿)患者中，目前并非所有都能被治疗，因为用于治疗和/或预防的A1AT作为批准药物不能充分供给。既定的治疗方法是基于静脉施用由供体血浆制备的含A1AT的溶液。既定的且目前推荐的剂量是每周每kg体重60mg A1AT，这对应每月每个患者平均消耗16-20克A1AT。这又对应平均15升血浆中所含的量。考虑到起始材料血浆中只有部分该抑制剂以纯形式的制剂获得，一个患者每月需要若干倍的15L正常血浆作为原材料。用于回收A1AT从而用于永久治疗患者需要的作为原材料的血浆总体积相当大。生产A1AT制剂的既定制备方法使用所谓的Cohn IV1浆作为起始材料。所述Cohn IV1浆利用本领域技术人员所熟悉的Cohn-Oncley方法或其改进方法制备，所述方法基于通过实质性地改变所加入乙醇的浓度、所调节的pH值和溶液温度而对血浆蛋白质分级分离。除了A1AT以外，所谓的级分IV1通常还含有很多种其它血浆蛋白，经之前的沉淀步骤其它血浆蛋白的数量已经部分降低。这种方法的变换方式是Kistler-Nitschmann法。因此，与Cohn IV1级分相似的级分以及其它含A1AT的级分，如所谓的上清液I+II+III，也可用作起始材料。已经描述了制备纯度不等的A1AT制剂的各种方法。已经多次报道了使用离子交换层析尤其是阴离子交换剂富集A1AT(Gray et al.，1960；Crawford et al.，1973；Chan et al.，1973；etc.)。然而，该制备步骤单独不产生具有与现有技术相当纯度的A1AT制剂。因此，部分地与离子交换剂组合而使用其它制备步骤。例如，使用吸附或沉淀方法，如与聚乙二醇(US-A-4,379,087)、锌鳌合剂或肝素吸附剂(US-A-4,629,567)等一起孵育。这些方法用于(进一步)纯化A1AT，但其中的每种方法都必须付出或多或少地损失产物收率的代价。原则上，产物损失随制备步骤数增加而增加。此外，这经常伴随制备时间的延长，这些都会降低A1AT的完整性和活性并增加生产成本。除了蛋白质制备步骤以外，所谓的病毒灭活步骤或去除(depletion)步骤是由血浆制备的蛋白质产品制备方法中的必需部分。所谓的SD(溶剂/去污剂)方法通过破坏它们的保护性脂质囊膜而灭活相应病毒，除此以外，热灭活方法，例如巴斯德消毒(60℃热处理10小时)，用于增加病毒安全性。经“纳滤器”过滤通常根据病毒大小保留病毒，而无论它们是具有脂质囊膜的或是没有脂质的。现有技术是在一种制备方法中整合两个工序，其中每一工序本身都有效并且基于不同原理，以使病毒安全性最大化。根据蛋白质不同，在这些工序中加入稳定剂如氨基酸或糖以使蛋白质稳定。因此，稍后必须将它们从含A1AT的溶液中除去。在SD方法中，加入去污剂作为病毒灭活的活性试剂，它必须在制备工艺的后续过程中用适当方法除去。为此，建立了与疏水基质的吸附，如使用固定化C18链的层析。这种层析也伴随产物收率的损失并包括方法中每个(进一步)层析步骤的上述缺点。此外，这些基质通常重复使用，即需要高成本和耗时的基质再生步骤。因此，已经描述了无需层析步骤的用于定性去除去污剂的可替代、有效而快速的方法(WO 94/26287，US-A-5,817,765)。因此，例如，使含去污剂的蛋白质溶液达到盐例如柠檬酸钠的超生理浓度(≥0.5M)，以形成含去污剂的颗粒，例如仅通过过滤就可以将所述颗粒分离出来。以下，该方法将称作“去污剂/盐析”法。在WO 94/26287的实施例中，“去污剂/盐析”法应用于三种溶解态分离蛋白，即转铁蛋白、抗凝血酶III和白蛋白。在实施例中，该方法分别导致恢复95％的蛋白质活性，并导致去污剂浓度降低。如果在使得靶蛋白产率不太受影响的条件下应用该方法，产物中的Triton浓度通常仍然是高的。在WO 94/26287的实施例4中，专利技术人能恢复95％的白蛋白活性，但得到含250ppm Triton X-100和35ppm TNBP的产物。尤其是当生产药用制剂时，应该避免超过50ppm、优选超过10ppm的TritonX-100浓度，并且一般来说，理想的是尽可能降低去污剂含量。本专利技术的目的是提供制备A1AT制剂的方法，所述方法尽可能有效、快速地得到高纯度和安全性的产品。优选的，在制备过程中，不应对A1AT的活性和/或质量产生不利影响，并且去污剂应该被除去到药用制剂可接受的水平。本专利技术的另一个目的提供纯化含A1AT的溶液的方法，在此过程中其它蛋白组分被去除。优选的，所述A1AT溶液还应该除去其它组分如脂质或病毒。通过从含A1AT的溶液制备A1AT的方法实现该目的，所述方法包括以下步骤(a)将含A1AT的溶液进行离子交换层析；(b)加去污剂和任选的溶剂来灭活脂质囊膜病毒；(c)随后增加盐浓度使去污剂盐析。此外，通过如权利要求1-19限定的实施方案，解决本专利技术的问题。从含A1AT的溶液例如从复原的血浆级分IV1(Cohn)中制备A1AT的方法，大体上仅由两个就富集A1AT而言非常高效的工序组成即利用阴离子交换剂的层析和用TritonX-100和TnBP的SD病毒灭活处理，随后盐析除去病毒灭活剂。已经发现最后提及的步骤也可非常有效地用于含A1AT的溶液。当含A1AT的溶液含有大量不本文档来自技高网...

【技术保护点】
从含Ａ１ＡＴ的溶液中制备Ａ１ＡＴ的方法，包括以下步骤：（ａ）将含Ａ１ＡＴ的溶液进行离子交换层析；（ｂ）加去污剂和任选的溶剂来灭活脂质囊膜病毒；（ｃ）随后增加盐浓度使去污剂盐析。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得拉舒尔茨，于尔根勒米施，
申请(专利权)人：奥克塔法马股份有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]