一种制备FVIII:C/FVIII:Ag比例提高的因子VIII的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于通过使用层析法制备FVIII:C/FVIII:Ag比例为至少0.7的因子VIII产品的方法，其中至少一个层析步骤通过采用以下来执行：对特异性结合因子VIII有亲和性的亲和层析树脂，所述亲和性受到固定在亲和层析树脂上的亲和配体的影响，所述亲和配体是针对因子VIII分子的酵母衍生的13kD Fab抗体片段；阴离子层析树脂；尺寸排阻树脂。根据该方法可获得的因子VIII产品具有>98％的单体含量，其用于治疗血友病和避免抑制剂的形成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种用于通过使用层析法制备因子VIII产品中FVIII:C/FVIII:Ag比例提高的因子VIII产品的方法，以及包含通过本专利技术的方法可获得的单体含量≥98％的产品的药物。专利技术背景天然因子VIII分子是在正常条件下以具有一条轻链(用于全长血浆来源的和B结构域缺失的FVIII；80kDa)和一条重链(用于200kDa血浆或重组全长来源的因子VIII和用于90kDaB结构域缺失的重组因子VIII)的复合体流通。重链和轻链关联的确切条件并未详知，但一些文章揭示了金属离子桥的参与连同疏水相互作用一起形成了复合体并使其结合在一起。已揭示，不同的金属离子参与包括钙、铜、锌、锰等的相互作用(1)。对于最近研发的B结构域缺失的重组因子VIII产品，已表明，该分子包含三种金属离子：钙、铜和锌(2)。没有金属桥的存在，仅因子VIII分子的轻链和重链不具有生物活性，但仍有抗原活性。该特点已被公开于若干出版物中(3，4)，即抑制剂的形成在活体内具有风险，特别是针对因子VIII轻链。因此，在给患者注射的因子VIII产品中，应该存在尽可能少量的单独的轻链和重链，FVIII:C/FVIII:Ag活性的比例应接近1.0(一)(5)，特别是对于因子VIII轻链。一般情况下，蛋白质的聚集在纯化过程中是一个危险因素，这不仅是因为会造成所需产品的损失，还会形成潜在的抑制剂(6)。在某些生化条件下，重组因子VIII可能聚集(7，8)，这将导致其生物活性显著降低。一个含有聚集的因子VIII的因子VIII产品将因此包含单体含量＜100％的无活性形式的因子VIII。药物蛋白产品的单体含量应接近100％且无活性形式的因子VIII(聚集体，片段等)的含量应尽可能低。已有许多方法描述了从血浆或重组产生因子VIII(rFVIII)的培养物中纯化因子VIII。例如WO2009/156430公开了一系列对因子VIII的纯化层析步骤，包括基于非动物来源的Fab的亲和步骤，其中13千道尔顿的配体结合因子VIII轻链。在该申请中提到的其他层析步骤包括阴离子和阳离子混合模式树脂、阳离子交换、阴离子交换和凝胶过滤。对于除去因子VIII的无活性形式或聚集体的含量的方面的信息在该专利专利技术中未提供。在该文章中，描述了新重组因子VIII的纯化和表征(9)，其是四步的因子VIII层析纯化方法，该方法包括用单克隆抗体作为与因子VIII的重链结合的配体的亲和步骤。其他三个步骤为混合模式层析树脂、阴离子交换树脂和凝胶过滤，对于除去因子VIII的无活性形式或聚集体的含量的方面的信息在该文章中未提供。在该文章中，使用肽配体作为因子VIII的cGMP生产的亲和层析的建立与验证中，描述了包含五个步骤的层析方法，包括基于肽的亲和步骤，其中2.7千道尔顿的配体结合因子VIII的轻链。描述了来自于培养过程中的过量的因子VIII轻链在肽亲和树脂的洗涤过程中被除去。其他四个层析步骤为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、疏水相互作用树脂和凝胶过滤步骤。其阐述了该肽亲和树脂除去过量的因子VIII轻链之后的两个层析步骤，但未进一步具体限定在哪个步骤中。对于除去因子VIII轻链以外的其他无活性形式或因子VIII聚集体的含量的方面的信息在该文章中未提供。在该文章即一种用于重组因子VIII化合物的捕获和纯化的新型亲和吸附剂的应用中(11)，描述了用于纯化因子VIII的基于Fab的13千道尔顿的配体亲和树脂，对于除去因子VIII的无活性形式或聚集体的含量的方面的信息在该文章中未提供。正如该文章中描述的，市售的重组因子VIII产品含有无活性的因子VIII形式(5)，(12)，如用生物活性因子VIII(因子VIII:C)相对于因子VIII的总量(因子VIII:Ag)的比例所测量的，其对于患者具有潜在的免疫反应方面的副作用。生物活性因子VIII被定义为具有因子VIII活性的因子VIII，其在活体正常条件下可以通过酶反应被激活成为因子VIIIa，这是用于止血的凝血级联的基本组成部分。生物活性因子VIII可用不同的体外分析方法进行测定(FVIII:C)，例如FVIII显色测定法和/或一期凝血测定(13)。显色测定法是两阶段光度测定法，其测量因子VIII作为辅因子的生物活性。因子VIII将因子X激活为因子Xa，而这又是酶促裂解成可以通过分光光度法来定量的产品。一期凝血测定法是基于含有因子VIII的试样纠正在磷脂、接触活化剂和钙离子存在下缺乏因子VIII的血浆的凝固时间的能力。纤维蛋白凝块出现的时间是在一个步骤中测得的。WO-A-2008/134310公开了一种稳定用于冷冻储存的重组蛋白的本体溶液的方法，其包括提供具有至少100mM的一价盐浓度的重组蛋白的部分纯化溶液，并添加足量碳水化合物至所述溶液，使得冷冻后该溶液具有-56℃或更高的玻璃化转变温度。WO2010/115866A1公开了分子和多肽，其包含至少一个与人类因子VIII或其生物活性部分具有显著同一性(同源性)的氨基酸序列，并公开了相关分子(如编码此类多肽的核酸)，包括此类多肽的组合物(例如药物制剂)，以及制备和使用此类多肽的方法。WO97/33178A1公开了一种用于检测含因子VIII的蛋白质组分的适用性的方法，对其的进一步处理包括巴氏消毒步骤，该步骤包括检测用于20-50kD范围的片段的起始材料。在此范围内的因子VIII片段会在之前用因子VIII治疗过的患者体中显著引起抑制剂的形成。甚至被这些片段污染的批次可以通过对亲水材料应用排阻层析被用于生产非常纯的无毒因子VIII。US4,675,385A公开了一种用于从重组商用因子VIII:C(复合因子VIII)浓缩液中大规模纯化人、牛和猪的促凝血蛋白因子VIII的快速简单的方法，该方法首先在低盐浓度条件下以及其次在高盐浓度条件下使用有次序的高效尺寸排阻层析法。层析分离是在填充有多孔珠的高效尺寸排阻层析柱上进行，该多孔珠的粒径为约13至约35微米，孔径约500至约2000埃，孔体积每克约1.0至约1.8毫升。第一层析分离是在缓冲水溶液中进行，使用缓冲水溶液作为洗脱液。将低分子量成分(杂质)与因子VIII和高分子量成分(杂质)分离。第二层析分离可以在因子VIII在含有浓度为约0.25M至0.45M钙离子的缓冲溶液中被解离后进行。在2.5x60cm的层析柱中，4克的商用因子VIII浓缩液可以在不到两小时内被纯化。该工艺可适于规模化。EP0412466A2公开了一种具有高比活性(specificactivity)和稳定性的巴氏杀菌的因子VIII浓缩物的制备方法，并且包括使用Al(OH)3、阴离子交换剂或Ca3(PO4)2，优选使用选自该组的两个不同的吸附剂，通过至少两次吸附从含有因子VIII的溶液中吸附杂质。FR2650393A1公开了获得具有比活性和高产率的因子VIII浓缩物，其中该浓缩物不含非人类来源的外来蛋白质。通过任意方法得到的因子VIII沉积在包含用第一缓冲液预平衡的阴离子交换凝胶的柱上。在因子VIII被装入层析柱中后，用第二缓冲液冲洗凝胶直至获得低于0.1的光密度。然后用第三缓冲液从凝胶中释放纯化的因子VIII。层析后，比活性是30/1600IU/mg。Cheng，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于通过使用层析法制备因子VIII产品中FVIII:C/FVIII:Ag比例为至少0.7的因子VIII产品的方法，其中通过采用对特异性结合因子VIII有亲和性的亲和层析树脂执行至少一个层析步骤，所述亲和性受到固定在亲和层析树脂上的亲和配体的影响，所述亲和配体是针对因子VIII分子的酵母衍生的13kD Fab抗体片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.20 EP 14151769.81.一种用于通过使用层析法制备因子VIII产品中FVIII:C/FVIII:Ag比例为至少0.7的因子VIII产品的方法，其中通过采用对特异性结合因子VIII有亲和性的亲和层析树脂执行至少一个层析步骤，所述亲和性受到固定在亲和层析树脂上的亲和配体的影响，所述亲和配体是针对因子VIII分子的酵母衍生的13kDFab抗体片段。2.一种用于将FVIII:C/FVIII:Ag比例提高为至少0.7并得到≥98％的高因子VIII单体含量及基本上不含聚集的因子VIII的方法，其中通过采用至少一个在阴离子交换层析树脂上的层析步骤来执行至少一个层析步骤。3.一种用于将FVIII:C/FVIII:Ag比例提高为至少0.7并得到≥99％的高因子VIII单体含量及基本上不含聚集的因子VIII的方法，其中通过采用尺寸排阻层析步骤来执行至少一个层析步骤。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述因子VIII分子是轻链和重链的复合体，提高的FVIII:C/FVIII:Ag比例是归因于因子VIII轻链、因子VIII重链和/或从所述复合体解离的因子VIII轻链/因子VIII重链的消耗。5.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述层析步骤是在因子VIII结合亲和树脂和解离的轻链在因子VIII洗脱之前被洗掉的条件下执行，其中在相当于浓度为0.1-0.5mol/kg氯化钠的低盐条件下发生因子VIII与亲和层析树脂的结合，然后在0.3-4mol/kg范围的氯化钠的增加的盐浓度下清洗亲和层析树脂，以除去轻链；和通过采用0.5-4mol/kg范围的氯化钠的盐浓度与40-60％的乙二醇组合，任选地洗脱和收集分离级分的因子VIII。6.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中所述亲和树脂是基于平均粒径为74μm的交联的琼脂糖基质，酵母来源的13kD的Fab抗体片段亲和配体通过亲水间隔臂结合到所述基质，使得所述配体更易被利用以结合因子VIII分子，所述亲和配体结合生物活性因子VIII分子的因子VIII轻链。7.根据权利要求1、4-6中至少一项所述的方法，其中所述亲和层析条件包括以下条件中的至少两个：-至少5000IU/mL树脂的生物活性因子VIII的树脂负载，优选为至少10000IU/ml
\t树脂，最优选超过20000IU/mL树脂；-因子VIII负载：0.1-0.5mol/kgNaCl，0.01-0.05mol/kgCaCl2，0.01-0.05mol/kgL-组氨酸，0.005-0.05％(w/w)聚山梨醇酯80，0.5-2％的TritonX-100，0.1-1％的pH6.2-6.8的TNBP；-洗涤：0.5-4mol/kgNaCl，0.01-0.05mol/kgCaCl2，0.01-0.05mol/kgL-组氨酸，0.005-0.05％(w/w)的pH6.2-6.8的聚山梨醇酯80；-因子VIII洗脱：0.5-4mol/kgNaCl，40-60％乙二醇，0.01-0.05mol/kgCaCl2，0.01-0.05mol/kgL-组氨酸，0.005-0.05％(w/w)的pH6.2-6.8的聚山梨醇酯80。8.根据权利要求1、4-7中至少一项所述的方法，其中所述亲和层析树脂是交联的琼脂糖基质。9.根据权利要求1、4-8中至少一项所述的方法，其中所述亲和配体结合FVIII的轻链部分并特异性地将其除去。10.根据权利要求2所述的方法，其中所述阴离子交换层析是在因子VIII结合阴离子交换层析树脂以及在生物活性因子VIII洗脱之前或之后从阴离子交换层析树脂除去生物无活性形式的条件下执行，其中在相当于浓度为0.01-0.15mol/kg氯化钠的低盐条件下负载因子VIII，以结合因子VIII和除去因子VIII的无活性形式，在相当于浓度为0.15-0.3mol/kg氯化钠的中盐条件下清洗阴离子交换层析树脂，以除去因子VIII的无活性形式；和通过采用相当于浓度为0.3-1mol/kg氯化钠的高盐条件以分离级分从阴离子交换层析树脂洗脱并收集完整的单体因子VIII。11.根据权利要求2或10所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯特凡·温厄，玛丽娜·达戴安，埃里卡·约翰逊，贝蒂·福克斯，
申请(专利权)人：奥克塔法马股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH