通过沉降灭活/去除凝血因子的方法技术

一种灭活或去除含蛋白质的溶液中的凝血因子的方法，所述凝血因子为FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa，FX，FXI和FXIa，所述含蛋白质的溶液从血液、血浆、血浆组分获得或通过重组手段获得，其中将所述含蛋白质的溶液与有机酸或其盐接触，同时进行搅拌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过沉降灭活/去除凝血因子的方法
本专利技术提供了一种灭活源自血液、血浆或者通过重组方法获得的蛋白制剂中凝血因子的方法。引言凝血因子作为凝血级联系统中接触活化或内源性凝血途径的一部分，在血液凝固和血凝块形成中发挥了重要作用。有证据表明，部分凝血因子，例如FXI，在药品制造过程中可能会被激活，所以剔除或至少灭活这些激活的凝血因子显得很有必要。更优选从要用于静脉内或皮下应用的医疗制剂中除去尽可能多的凝血因子，以避免在病人中发生不良和威胁健康的血凝块形式的血栓事件。减少混有其他蛋白质，例如免疫球蛋白或白蛋白的溶液中的FXIa或FXI的方法是已知的，但包括耗时的层析法，在使用特定的亲和树脂时，这还意味着大量的成本投入。Bouma等;J.Biol.Chem；1977；252（18）；6432-7教导了从不含可测量（小于0.01U/ml）FXIa的血浆中提纯FXI的方法，该方法包括四个连续的层析步骤，首先为DEAE层析，接着为QAE-和SP层析，以及利用SP-葡聚糖凝胶的第二层析步骤。在某些情况中，利用刀豆蛋白A琼脂糖亲和凝胶进行额外的层析纯化来消除γ-球蛋白（免疫球蛋白G）。Komiyama等;Thromb.Res;1992;66;397-408描述了借助FXI的固定化抗体除去血小板浓缩物中FXI/FXIa的方法。因此，本领域迫切需要一种光谱、高效、简单的去除凝血因子的方法。专利技术概述本专利技术的目的提供从包含激活的凝血因子及其未激活的酶原的来源中灭活和/或除去这些蛋白质的方法。本专利技术公开了从含有激活的和/或未激活的凝血因子，特别是凝血因子FXIa和FXI，但也包括FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa和FX的来源中灭活和/或去除这些凝血因子的方法。感兴趣的来源包括血液或血浆或其诸组分，特别是血浆中主要含有免疫球蛋白或白蛋白作为治疗活性蛋白的诸组分。出乎意料地发现，将含凝血因子的免疫球蛋白G（IgG）溶液与有机酸或其盐接触，同时在约0℃至约40℃的温度下、约3.5至约6.0的pH范围下搅拌，不仅FXIa被灭活或去除，其他凝血因子同样被灭活或去除。所述的有机酸可以是C4到C10，饱和的或不饱和的有机酸或其盐，特别是碱土金属的盐，如钠盐。在本专利技术的一个实施方式中，有机酸为丁酸（C4），戊酸（C5），己酸（C6），庚（C7），辛酸（C8），壬酸（C9），和/或癸酸（CIO）或其盐，如钠盐。优选地，有机酸是辛酸，或它的盐是辛酸钠盐，但戊酸和癸酸的盐也认为是非常适合的。有机酸或其盐的施用浓度为5至50mmol/L。蛋白质和有机酸或其盐搅拌45至180分钟，优选地，55至120分钟，随后将产生的沉淀物与上清液分离。搅拌时可任选使用助滤剂如硅酸盐，例如选自以下的天然产生或合成的硅酸盐：硅藻土、煅制氧化硅、珍珠岩或沸石。这种灭活或去除步骤的优势在于可以将其引入提纯源自血液的蛋白质的任何已知方法的合适之处。得到的蛋白质溶液用现有技术中已知的方法进一步处理。方法特别适合用来制造免疫球蛋白制剂。专利技术详述本专利技术提供从包含凝血因子的来源中灭活和/或除去此类蛋白质的方法。这种来源的例子有主要含有免疫球蛋白，特别是免疫球蛋白G（IgG抗体）或白蛋白的蛋白质溶液。本专利技术可避免采用去除凝血因子FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa，FX，FXI和FXIa所用的层析操作。当然，可以为其它原因而额外采用层析法纯化步骤。出乎意料的是，本研究发现，将含有凝血因子的复杂混合物的溶液，特别是血浆分级的I+II+III组分或类似组分，与有机酸或其盐，特别是钠盐，在1℃至40℃，特别是2℃到30℃的温度下，在约4至约6，特别是4.2到5.6的较宽pH范围内接触，能将所述的凝血因子灭活或去除到超出检测限的水平。当溶液与浓度至少为20mmol／L的辛酸或其盐接触时，还观察到XI因子抗原（FXI：Ag）的值降低到低于5mIU／mgIgG。在用有机酸或其盐处理期间，pH值可以在所述范围内变动，或在该范围内维持基本恒定，其中与固定值的偏差为+/-0.3。有机酸或其盐，特别是辛酸钠的施用浓度范围从5到50mmol/L，特别是从10到22mmol/L。在持续搅拌下，蛋白和有机酸或其盐接触45到180分钟，特别是55到120分钟。搅拌时可任选使用助滤剂，如硅酸盐，例如选自下组的天然产生的或合成硅酸盐：硅藻土、煅制氧化硅、珍珠岩或沸石；并在接触完成后与产生的沉淀物一起除去。沉淀物和上清液的分离可以使用通用已知的方法进行，可通过过滤，离心或沉降进行，这过程一般再需要60到120分钟。通过沉降来分离可能需要更长时间。一个沉淀和分离周期可能要持续5个小时，从开始沉淀到分离结束。特别是，如果第一次灭活或去除可能不足以完全灭活或去除有些凝血因子，这些凝血因子的残留量仍在检测限之上，可适当的进行第二次的灭活或去除步骤。将沉淀物和上清液分离的方法是众所周知的，包含沉降，过滤或离心或它们的组合。因此，利用有机酸或其盐进行的第二灭活可纳入作为备选项。该灭活或去除步骤可以引入提纯源自血液的蛋白质的任何已知方法的合适之处。产生的蛋白质溶液用现有技术已知的方法做进一步处理。常规处理包括用于去除残留量的有机酸或其盐的阴离子层析法，溶剂/去污剂处理（S/D处理），超滤和渗滤，制成制剂，无菌过滤和灌装到最终容器中。产品还可任选进行冻干处理。最终IgG产品的抗体浓度通常是在5-16%范围内，但抗体浓度最高约25%也是可能的。必须指出，由于静脉内施用时粘度的原因，浓度高于20%的产品需要特殊制成制剂。发现IgG抗体的回收能从下述处理中获益：用一种有机酸或盐在约2-8℃的低温下处理，随后用不同的有机酸或其盐在20-40℃的室温下处理。此类方法的一个例子为，先在2-8℃温度下用辛酸钠盐处理，将沉淀物分离后用戊酸钠盐或癸酸钠盐在20-40℃下处理溶液。分析方法为了确保在生产过程中凝血因子不发生活化或浓缩，在整个过程中都会取出进程中样品(in-processsample)来分析上述的凝血因子。所有进程中样品以及最终容器中的产品都测试凝血因子存在与否。由于灭活或去除，最迟到第二次有机酸或其盐处理后，不可能检测到凝血因子。即使在浓缩的最终产品中也没有达到或超过凝血因子的检测限。此外，用NATEM和凝血酶生成分析（TGA）分析最终产品中促凝活性，所有最终产品都没有检测到凝血活性。促凝活性基于血栓弹性描记法(thrombelastography)的原则，采用购自公司的凝血分析仪与测试和购自的试剂来测定缺乏XI因子的血浆的促凝活性测定。所有试验都是对最终产品进行检测（IgG浓度5％，10％和16％），超过3000秒（50分钟）后终止，显示没有促凝活性。凝血酶生成分析利用Technoclone公司的TGA，对XI因子缺乏的血浆以及合并的正常血浆作凝血酶生成分析（TGA）。测定了时滞(Lag-time)，即凝血酶形成的起始，测定了凝血酶峰值和TTP（即到峰值时间）。结果汇总在表1，结果显示，，XI因子缺乏血浆（FXI-PD）中，有一定长度延长的时滞和TTP，并且凝血酶峰值减少至血浆合并值的10%左右。表1：分析因子FII,FVII,FVIIa,FIX,FIXa,FX,FXI和FXIa除了FIXa和FXIa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灭活或去除含蛋白质的溶液中的凝血因子的方法，所述凝血因子为FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa，FX，FXI和/或FXIa，所述含蛋白质的溶液从血液、血浆、血浆组分获得或通过重组手段获得，其中将所述含蛋白质的溶液与有机酸或其盐接触，同时进行搅拌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.04 EP 11153349.3;2011.07.19 EP 11174559.21.一种灭活或去除含蛋白质的溶液中的凝血因子的方法，所述凝血因子为FII，FIX，FIXa，FX，FXI和/或FXIa，所述含蛋白质的溶液从血液、血浆、血浆组分获得或通过重组手段获得，其中在1℃至40℃的温度下，在4.0至6.0的pH范围内将所述含蛋白质的溶液与有机酸或其盐接触，同时进行搅拌；所述有机酸选自戊酸(C5)，辛酸(C8)，癸酸(C10)或其盐类。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机酸是辛酸或癸酸，或这些酸的盐。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：所述溶液与有机酸或其盐在2℃至8℃的温度下的第一次接触，所述溶液与相同的酸或其盐或不同的酸或其盐在20℃至30℃的温度下的第二接触。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·卡尔，A·佐什林，K·阿荷尔，
申请(专利权)人：奥克塔法马股份有限公司，
类型：
国别省市：