α1-抗胰蛋白酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种从人血浆分离出的组分Ⅳ－１中纯化安全有效的α１－抗胰蛋白酶制备方法。本发明专利技术采用血浆分离的废弃物，组分Ⅳ－１为原料，提取有高度治疗价值的α１－抗胰蛋白酶，大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力，降低成本，提高经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，尤其是指用沉淀和层析法从血浆或血浆蛋白分离的组分中纯化α1-抗胰蛋白酶的制备方法。
技术介绍
α1-抗胰蛋白酶是一种大约分子量为52000-55000道尔顿(Da)的糖蛋白。此蛋白是由几个寡核甘酸共价连接的单链蛋白，它是一种内源性蛋白酶抑制剂，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰弹性蛋白酶、血管紧张肽原酶、皮肤胶原蛋白酶、脲激酶和分叶核淋巴细胞蛋白酶。近来应用α1-抗胰蛋白酶治疗由于α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的遗传性疾病和后天获得性α1-抗胰蛋白酶缺陷性疾病。给予α1-抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴细胞弹性蛋白酶。淋巴细胞弹性蛋白酶能破坏肺的外源蛋白。当α1-抗胰蛋白酶缺失时，不能很好地调节弹性蛋白酶的活性，使弹性蛋白酶就破坏肺组织导致肺组织损伤引起肺气肿，α1-抗胰蛋白酶能成功的用于治疗肺气肿、慢性气管炎和气管炎等。目前，α1-抗胰蛋白酶用于治疗肺气肿等疾病是供不应求，由于用于治疗的α1-抗胰蛋白酶基本上是来源人血浆，原料来源有限，为了最大地满足临床病人的需求，应最大可能地提高血浆来源的α1-抗胰蛋白酶产率。同时也要严格要求纯度，因微量杂蛋白可引起病人的免疫反应而产生副作用。此外，应该应用现代先进的简化工艺从血浆分离α1-抗胰蛋白酶和去除病毒，最大限度缩短纯化工艺时间，提高效率。目前，中国尚无此类产品，完全依赖于进口，由于价格昂贵，病人得不到治疗，因此必需填补这项空白。从血浆分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法繁多，举例如下海因(Hein)等人发表的文章和专利〔欧洲呼吸杂志，第9卷增刊16-20页(Eur.Respir.J.916s-20s(1990)和美国专利4,697,003〕阐明用孔氏(Cohn)组分IV-1作原料，用聚乙二醇(PEG)沉淀，接着用DEAE琼脂糖交换层析分离纯化。最后产品纯度达约60％和45％产率，此工艺生产的产品纯度不高，产率低。来宾(Lebing，Wytold)发表的专利〔美国专利WO02/48176 A1(2000.12.14至2002.06.20公布)〕是应用沉淀法除去部分杂蛋白质，收集上清通过阴离子交换介质收集含α1-抗胰蛋白酶溶液再用阳离子交换介质纯化，经冻干加热法、去污剂(Tween20)及纳米膜过滤等方法去除脂包和非脂包病毒。此纯化工艺及灭活/去除病毒步骤繁多，延长了生产时间。朱威，祝慈芳等中国生物制品杂志2001，14(2)97-101，此文叙述了从人血浆分离的组分IV-1纯化α1-抗胰蛋白酶。主要工艺是孔氏组分IV-1(Cohn IV-1)抽提液经沉淀、超滤、离子交换及凝胶过滤，提纯α1-抗胰蛋白酶，用巴氐法灭活病毒。祝慈芳，朱威中国生物制品学杂志2004，17(1)39-41，制备工艺同上，除简单描述工艺外，主要是进行了急性肺损伤的治疗效果的试验观察。上述文章采用一次病毒灭活，尚不能完全灭活/去除有抗力的病毒，例如细小病毒B19，此外采用两步PEG沉淀工艺，可以进一步简化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提出一种从人血浆分离的组分IV-1中纯化安全有效的α1-抗胰蛋白酶制备方法。本制备方法能提高产品纯度、产率，同时缩短了工作时间，节约了原材料，降低了生产成本。本专利技术所提供的技术方案是一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，包括以下步骤a、采用孔氏低温乙醇法制得血浆组分IV-1，沉淀；b、用pH值为9.0～9.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，将组分IV-1充分溶解，然后在34～40℃加热60～90分钟；c、在上述溶液中加入分子量为3000～6000da的聚乙二醇，使体积百分浓度为8～12％，静置后离心，得到上清液，目的是去除组分IV-1中杂蛋白及病毒；d、第一次病毒灭活用有机溶剂和去污剂来灭活脂包膜病毒；e、用阴离子交换法层析，用含0.02～0.15M的NaCl-磷酸缓冲液，pH值为6～8，洗脱除去杂蛋白，得到α1-抗胰蛋白酶溶液；f、第二次病毒灭活，采用巴土德消毒法灭活脂包和非脂包病毒；g、超滤，去除保护剂，浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液；h、浓缩溶液中加入保护剂，调节蛋白浓度为10～50mg/ml；i、过滤除菌，分装，冷冻干燥。其中，聚乙二醇溶液中聚乙二醇最佳分子量为4000。本专利技术有如下优点1、采用血浆分离的废弃物，组分IV-1为原料，提取有高度治疗价值的α1-抗胰蛋白酶，大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力，降低成本，提高经济效益；2、纯化α1-抗胰蛋白酶，采用的是PEG沉淀法和离子交换层析法，可获得高纯度的α1-抗胰蛋白酶，简化了工艺，缩短了生产时间，提高了效率；3、采用二步病毒灭活工艺，同时纯化步骤中的PEG沉淀也有去除病毒作用，确保了产品的安全性。具体实施例方式下面结合实施例来详细说明本专利技术。实施例一制备α1-抗胰蛋白酶的原料是孔氏(Cohn)6法制得的血浆组分IV-1，沉淀，将组分IV-1沉淀制备成溶解液，具体方法如下组分IV-1沉淀溶解于10～25倍体积的pH值为9.0～9.8的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中(W/V)，置于2～10℃中搅拌溶解，大约60～90分钟，混合溶解后，调pH值或不调节pH值，如果调节pH值，则用0.5M的NaOH溶液缓慢加入，至pH值为9.0～9.5，充分搅拌混合后，置于35～40℃加热60～90分钟，使组分IV-1充分溶解，同时并激活α1-抗胰蛋白酶。实施例二组分IV-1溶液含有多种蛋白质，例如白蛋白、纤维蛋白原、球蛋白、转铁蛋白及变性蛋白等，必须将α1-抗胰蛋白酶与其他杂蛋白分开，可采用下列步骤将上述孔氏(Cohn)组分IV-1溶液冷却到2～10℃，然后边搅拌边加入8～12％的PEG4000溶液，搅拌30分钟后，再用0.5M的HCl溶液调节pH值至5.0～6.0，继续搅拌20～40分钟，2～8℃静置数小时或过夜，使之充分沉淀。PEG是非离子沉淀剂，而且作用温和，使α1-抗胰蛋白酶活性不易损失。PEG沉淀可去除杂蛋白和病毒；沉淀经过滤或离心(8000rpm，30分钟)，弃去沉淀，保留含有α1-抗胰蛋白酶的PEG上清液。实施例三将含有α1-抗胰蛋白酶的聚乙二醇的上清液，用0.5～1.0M的NaOH调节pH值至中性，然后加入吐温80/三磷酸丁脂(S/D)，终浓度分别为1％和0.3％在24℃±1℃，孵育8小时，这种处理方法能有效地灭活脂包膜病毒，如HBV、HCV和HIV等。此方法灭活病毒，大大提高了制品的安全性。实施例四含有α1-抗胰蛋白酶的PEG和S/D溶液经阴离子交换介质层析，在层析前要调节上清液离子强度最小和适当的pH值(为6～8之间)，使α1-抗胰蛋白酶结合到阴离子交换介质上。离子交换层析过程用含0.02～0.05M的NaCl-磷酸缓冲液(pH值为6-8)，约3～4柱体积，洗脱来平衡柱子，然后上约1～6柱体积经过滤的样品，流速为80～150cm/小时，使α1-抗胰蛋白酶结合到柱子上，经平衡缓冲液冲洗非结合蛋白(2～6柱体积)至基线后，用含0.04～0.06M的NaCl-磷酸缓冲液(pH值为6～8)洗涤结合的杂蛋白，约2～8柱体积，再用含0.06～0.150M的pH 6～8的磷酸缓冲液洗脱，并收集α1-抗胰蛋白酶洗脱液，其它结合在层析介质上的蛋白质用0.5～2.0M的NaCl-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α１－抗胰蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：ａ、采用孔氏低温乙醇法制得血浆组分Ⅳ－１，沉淀；ｂ、用ｐＨ值为９．０～９．８的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，将组分Ⅳ－１充分溶解，然后在３４～４０℃加热６０～９０分钟；ｃ、在上 述溶液中加入分子量为３０００～６０００道尔顿的聚乙二醇，使体积百分浓度为８～１２％，静置后离心，得到上清液；ｄ、第一次病毒灭活：用有机溶剂和去污剂来灭活脂包膜病毒；ｅ、用阴离子交换法层析，用含０．０２～０．１５Ｍ的ＮａＣｌ－ 磷酸缓冲液，ｐＨ值为６～８，洗脱除去杂蛋白，得到α１－抗胰蛋白酶溶液；ｆ、第二次病毒灭活，采用巴士德消毒法灭活非脂包膜与脂包膜病毒；ｇ、超滤，去除保护剂，浓缩α１－抗胰蛋白酶溶液；ｈ、浓缩溶液中加入保护剂，调节蛋白浓 度为１０～５０ｍｇ／ｍｌ；ｉ、过滤除菌，分装，冷冻干燥。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卜凤荣，宿艳笋，陈祥松，李昭，
申请(专利权)人：河北大安制药有限公司，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]