一种分离获得羊膜上皮细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离获得羊膜上皮细胞的方法，该方法包括：将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育；然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化；将上清液离心后获得羊膜上皮细胞。本发明专利技术操作简单，且能保持细胞原有活性及生长状态，提高羊膜上皮细胞的得率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体的说涉及。
技术介绍
羊膜上皮细胞(amn1tic epithelial cells, AECs)在受精后第8天由外胚层细胞发育而来，使其可能维持原肠胚形成胚胎干细胞的可塑性。人羊膜上皮细胞不表达HLA-A，B，C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反应。在一定条件下，羊膜上皮细胞可分化为成熟的神经元细胞，毛囊和皮肤上皮细胞，羊膜上皮细胞理论上可以分化成为各种组织细胞。因此，对羊膜上皮细胞培养方法的探索及对羊膜上皮的生长特性的研究具有重要意义，可为将来的组织工程应用奠定基础。 人羊膜组织由来源于外胚层的羊膜上皮细胞和中胚层的羊膜间质细胞组成。人羊膜上皮细胞源于外胚层羊膜细胞，保持着早期外胚层细胞的多潜能特性。从正常分娩的胎盘羊膜中，新分离的人羊膜上皮细胞具有干细胞某些表面抗原标志。如SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81, S0X-2，FGF-4 和 Rex-1，部分人羊膜上皮细胞表达 c_kit 和 Thy-1，所以可以用这些抗原的抗体进行ACEs的检测。 目前，AECs已被证实具有肝细胞的某些特性和功能。采用肝细胞生长因子和地塞米松等为诱导剂对人AECs进行原代培养，RT-PCR检测到肝细胞部分相关基因的表达，提示人ACEs具有分化为成熟肝细胞的潜能。 EGF是由53个氨基酸组成的相对分子质量较低的单链多肽，具有多种生物活性，能刺激体内多种类型的组织细胞分裂和增生。在最初分离的hAECs的存活率不是很高，并且贴壁效果也不是很好，而在添加了 EGF后就能有利于hAECs的长期培养，同时抑制了其他类型细胞的生长。 羊膜上皮细胞体外培养的关键在于原代培养，原代培养能否成功很大程度取决于能否获得足够数量活力好的上皮细胞。原代培养分为组织块培养和酶消化法培养，组织块培养由于不是每个组织块都能培养成功，且容易混杂有成纤维细胞污染，培养形成单胚层的时间较长，不利于快速大量获取细胞，难以满足组织工程的需要。国外有采用胰蛋白酶分步多次消化，步骤繁琐，而且单纯的用胰蛋白酶很难获得足够的上皮细胞，且胰蛋白酶消化对细胞的损伤大，消化下来的细胞不易贴壁生长。
技术实现思路
本专利技术的内容在于克服以上技术不足，提供了，该方法为: 将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育； 然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化； 终止消化并过滤； 将滤液离心后获得羊膜上皮细胞。 其中所述的胶原酶为IV胶原酶或II胶原酶； 其中胶原酶溶液是将Ig胶原酶溶解在500ml基础平衡盐溶液中得到的； 其中基础平衡盐溶液的制备是用0.4g的KC1、0.06g的KH2P04、a 132g的Na2HPO4.12H20、8g 的 NaCl、0.35g 的 NaHC03、1.0g 的 D-葡萄糖、0.1Og-0.20g 的链霉素(优选 0.20g)、0.06g-0.12g的青霉素(优选0.12g)，用水定容为IL得到的。 其中胰蛋白酶溶液是将0.5g胰蛋白酶和0.04g EDTA溶解在200ml基础平衡盐溶液中而成。 具体的说，本专利技术的，包括如下步骤: 从胎盘上分离得到羊膜组织，用基础平衡盐溶液或PBS溶液冲洗后剪碎； 将羊膜组织中加入胶原酶溶液，37°C下孵育1-2小时(优选2小时)； 然后将混合了胶原酶的组织块在200g下离心5分钟，弃掉上清液； 再加入胰蛋白酶溶液，在37°C振荡消化10-20分钟(优选20分钟)，用含10%胎牛血清的标准培养基终止消化； 将消化后的组织块经200目滤网过滤； 将滤液在200g下离心5分钟，弃上清，使用含10%胎牛血清的完全培养基重新悬浮均匀细胞，获得羊膜上皮细胞； 其中所述的标准培养基，是900ml DMEM培养基中加入丙酮酸钠0.1lOOg, L-谷氨酰胺0.1461g、β -巯基乙醇3.8574g、10mM非必需氨基酸1ml ;所述的10mM非必需氨基酸配方为L-丙氨酸1500mg/L、L-天门冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L-谷氨酸1470mg/L、甘氨酸 750mg/L、L-脯氨酸 1150mg/L 和 L-丝氨酸 1050mg/L ； 其中所述的完全培养基，是标准培养基中添加胎牛血清和EGF配制而成；添加后胎牛血清的体积浓度为10%，EGF添加后的浓度为10ng/ml。 本专利技术的分离获得羊膜上皮细胞的方法为胶原酶一胰蛋白酶联合消化法。先用胶原酶处理韧性较强的羊膜组织，消化分解间质细胞，获得较纯的成片上皮细胞，再用胰蛋白酶消化稍稍分离细胞片，得到的上皮细胞比较多且活力好，容易贴壁生长。 EGF (表皮生长因子)是由53个氨基酸组成的相对分子质量较低的单链多肽，具有多种生物活性，能刺激体内多种类型的组织细胞分裂和增生。在胚胎干细胞或间充质细胞等的分化研究中，经常将这种生长因子添加到培养液中，本专利技术使用了 10ng/ml的EGF促进了 AECs的体外扩增中可能发挥着重要作用。 与现有的分离羊膜上皮细胞的方法相比，本方法的优点为:操作简单快捷，克服了组织块法获取细胞时间过长、细胞量过少及易掺杂大量成纤维细胞和单纯胰蛋白酶分步多次消化法步骤繁琐、对细胞损伤大的不足。本专利技术中，羊膜被剪成小块，使得每小块羊膜在相同的条件下，获得的AECs均衡一致，利用本专利技术的方法，每张羊膜可分离得到的羊膜上皮细胞量在17?108，细胞活率在90%以上，并能够长时间的保存而不失其活性，解决了此类资源得不到高效利用的现状，保证了临床应用中干细胞的数量和质量。 【附图说明】 图1为实施例3获得的原代羊膜上皮细胞培养三天后的AECs的细胞动态图； 图2为实施例3获得的原代羊膜上皮细胞培养五天后的AECs的细胞动态图； 图3为实施例3获得的AECs传代培养三天后的细胞动态图； 图4为实施例3获得的AECs传代培养后的SSEA-4的流式细胞术检测结果图； 图5为实施例3获得的AECs传代培养后的HLA-DR的流式细胞术检测结果图。 【具体实施方式】 为更近一步阐述本专利技术为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本专利技术提出的一种人羊膜上皮细胞分离的方法，其【具体实施方式】、特征及其功效，说明如下。 标准培养基:是900ml DMEM培养基中加入丙酮酸钠0.llOOg、L-谷氨酰胺0.1461g、β -巯基乙醇3.8574g、10mM非必需氨基酸1ml ;所述的10mM非必需氨基酸配方为L-丙氨酸1500mg/L、L-天门冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L_谷氨酸1470mg/L、甘氨酸 750mg/L、L-脯氨酸 1150mg/L 和 L-丝氨酸 1050mg/L ； 完全培养基:是在上述标准培养基中添加胎牛血清和EGF ;添加后胎牛血清的体积浓度为10%，EGF的浓度为10ng/ml。 实施例1: 首先取经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖宫产分娩产妇的新鲜胎盘一个，由0.4g的KCl、0.06g的ΚΗ2Ρ04、0.132g的Na2HPO4.12H20、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3U本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离获得羊膜上皮细胞的方法，其特征在于该方法为：将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育；然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化；终止消化并过滤；将滤液离心后获得羊膜上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种分离获得羊膜上皮细胞的方法，其特征在于该方法为: 将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育； 然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化； 终止消化并过滤； 将滤液离心后获得羊膜上皮细胞。2.根据权利要求1所述的分离获得羊膜上皮细胞的方法，其特征在于: 其中所述的胶原酶为IV胶原酶或II胶原酶； 其中胶原酶溶液是将Ig胶原酶溶解在500ml基础平衡盐溶液中得到的； 其中基础平衡盐溶液的制备是用0.4g的KC1、0.06g的ΚΗ2Ρ04、0.132g的Na2HPO4.12H20、8g 的 NaCl、0.35g 的 NaHC03、l.0g 的 D-葡萄糖、0.lOg-0.20g 的链霉素、0.06g-0.12g 的青霉素，用水定容为IL得到的； 其中胰蛋白酶溶液是将0.5g胰蛋白酶和0.04g EDTA溶解在200ml基础平衡盐溶液中--? 。3.根据权利要求1或2所述的分离获得羊膜上皮细胞的方法，其特征在于包括如下步骤: 从胎盘上分离得到羊膜组织，用基础平衡盐溶液或PBS溶液冲洗后剪碎； 将羊膜组织中加入胶原酶溶液，37°C...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴明远，刘洋，李建有，胡少青，张丽丽，赵静，叶萌，王浩鹏，叶健，孙迎秋，袁文杰，
申请(专利权)人：协和华东干细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33