一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台技术

本发明专利技术公开了一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台，该方法包括：取人脐带进行安全性检测；消毒，用冲洗液冲洗；剪取人脐带根部预设长度，用冲洗液冲洗；剪成预设大小的小块，加入培养基，混匀后离心，弃去上清，再离心，去除冲洗液残留；将离心沉淀的组织块与培养基混匀后移入培养箱中培养；扩增；冻存。该平台包括：脐带供者个人信息单元、采集接收记录单元、标本送检记录单元、检测结果报告单元、分离记录单元、试剂批号单元、分离交接确认单元、培养记录单元、冻存入库信息单元及各流程操作人员记录单元。本发明专利技术的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台，简化了分离步骤，减少了耗能耗材，提高了细胞收集效率。

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台
本专利技术涉及干细胞库
，特别涉及一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台。
技术介绍
脐带间充质干细胞(UmbilicalCordMesenchymalStemCells，UCMSCs)，是指存在于脐带华通氏胶(Wharton’sjelly)和血管周围组织中的一种间充质干细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。来源于脐带的间充质干细胞因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子的总量也非常高，便于扩增和传代，在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景，是间充质干细胞的理想来源。脐带间充质干细胞具有重要的临床用途：①造血干细胞移植：增强造血功能,促使造血干细胞移植物的植入,治疗移植物抗宿主病(GVHD)。②组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤、肝脏损伤、脊髓损伤和神经系统疾病。③自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。④作为基因治疗的载体。干细胞种子库是一个采用可数字化、可工程化、可应急处理的深低温(-196℃)储存系统，是运输、制备、质量检测、保存干细胞种子以及相关资料和信息的场所。脐带间充质干细胞库的主要工作是将新生儿的脐带采集后经过检测、分离、培养、冷冻后储存起来，并在需要时可以将健康的间充质干细胞和相关资料供临床使用。随着目前全球健康产业的兴起，细胞治疗成为医学界的主要研究课题，而这其中干细胞疗法是当今医学研究最前沿也是最热门的方向之一，发展迅猛。因此，建立并优化干细胞种子库变得尤为重要。但是现有的干细胞建库方法尚存在缺点，例如：分离步骤繁多，污染风险大，引入外源性动物蛋白，检测项目不全面，信息化建设不完善等。申请号为：200510015492.2中国专利技术专利公开了一种人胎盘、脐带间充质干细胞库及其构建方法，本专利技术的构建步骤包括：(1)取人胎盘、脐带进行检测，用磷酸缓冲液冲洗涤后粉碎，加磷酸缓冲液稀释；(2)加入胶原酶消化40～70分钟；(3)加入磷酸缓冲液稀释；(4)加入胰酶消化10～30分钟，加入血清终止反应；(5)将步骤(2)及步骤(4)所获得的细胞混合，离心，弃去上清液，用磷酸缓冲液洗涤，再离心，弃去上清液，即获得间充质干细胞；(6)将间充质干细胞置液氮冷冻，按其ABO/Rh分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人胎盘、脐带间充质干细胞库。申请号为：200910055219.0的中国专利技术专利公开了一种利用新生儿脐带为资源的脐带间充质干细胞库的构建方法，本专利技术由下述步骤组成：(1)取人脐带进行ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、微生物免疫检测、用缓冲液冲洗去除残留血液，剪碎，获得人脐带组织；(2)向步骤(1)所获得人脐带组织中加入1-3倍体积的0.05％-0.2％胶原酶消化，所述胶原酶消化温度为37℃，消化时间为2h，并获得消化后组织；(3)加入缓冲液稀释步骤(2)消化后组织，混匀、离心，离心力为600g，时间为15分钟；(4)弃上清，加入缓冲液重悬步骤(3)沉淀，过200目筛网，收集滤液，离心，离心力为450g，时间为10分钟，重复两次，即获得人脐带间充质干细胞；(5)将步骤(4)得到的人脐带间充质干细胞按2×104/cm2接种于塑料培养皿，用含10％FBS的LG-DMEM培养基，置37℃、5％CO2培养箱培养，2天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3天后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞，并用冷冻保护剂预处理，分装放入冻存管，所述冷冻保护剂由10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM组成。(6)将步骤(5)获得的人脐带间充质干细胞置液氮保存，按其ABO/Rh分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脐带间充质干细胞库。上述方法存在一些缺点和不足：分离培养步骤较为繁琐，操作耗材耗时；对细胞检测覆盖性不足；试剂中含有外源性蛋白对间充质干细胞的安全性产生影响；信息化建设不够完善。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术中存在的问题，提出一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台，简化了分离步骤，减少了耗能耗材，提高了细胞收集效率，适用于规模化建库及生产应用。为解决上述技术问题，本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术提供一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法，其包括以下步骤：S11：取人脐带进行安全性检测；S12：对人脐带进行分离纯化，得到人脐带间充质干细胞；所述步骤S12具体包括：S121：对人脐带进行消毒后，用冲洗液进行冲洗；S122：剪取冲洗后的人脐带的根部预设长度，去除血管和淤血后，用冲洗液进行冲洗；S123：将步骤S122得到的人脐带标本放置于培养瓶中，剪成预设大小的小块，加入培养基，混匀后进行离心，弃去上清，然后再进行离心，去除冲洗液残留；S124：将步骤S123中离心沉淀的组织块与培养基混匀后移入培养箱中进行培养；S13：对所述人脐带间充质干细胞进行扩增；S14：对所述人脐带间充质干细胞进行冻存。较佳地，所述步骤S124中的培养基为细胞无血清培养基。较佳地，所述步骤S124中在培养过程中对培养基进行一次或多次更换，细胞培养效果更好，培养速度更快。较佳地，所述步骤S121中的冲洗液为D-Hank′s平衡盐溶液；和/或，所述步骤S122中的冲洗液为D-Hank′s平衡盐溶液。以往细胞培养中所用的缓冲溶液主要是磷酸缓冲液(PBS)，而D-Hank′s平衡盐溶液中盐成分较PBS复杂,无机盐浓度接近大部分动植物细胞的水平，可在分离、培养过程中减少对细胞的损伤。较佳地，所述步骤S14具体包括：待所述人脐带间充质干细胞的融合率达到预设要求时，吸取预设容量的原培养液加入离心管留样，送至微生物免疫进行支原体检测，吸取预设容量的原培养液，送至微生物免疫进行细菌检测，离心前吸取两份预设容量的细胞悬液样本，一份使用流式细胞仪检测特征表面标记鉴定所得细胞为间充质干细胞，另一份送至微生物免疫进行TP53抑癌基因检测以及内毒素检测；离心后将沉淀细胞与细胞无血清冻存液混匀后移入冻存管进行冻存。较佳地，所述步骤S14中的离心后将沉淀细胞与细胞无血清冻存液混匀后移入冻存管进行冻存之前还包括：离心后收集一部分沉淀细胞来绘制成长曲线，来判断细胞活力。较佳地，所述步骤S11中的安全性检测包括：HLA分型检测、ABO/Rh血型检测、HIV免疫检测、乙肝表面抗原检测、丙肝表面抗原检测、梅毒抗体检测以及巨细胞病毒抗体检测中的一种或多种。较佳地，所述步骤S14之后还包括：S15：对所述人脐带间充质干细胞进行分化；具体为：将所述人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞、肝样细胞以及脂肪细胞中的一种或多种。较佳地，所述步骤S14之后还包括：S16：建立检测平台，对人脐带间充质干细胞种子库的构建进行信息化建设与管理。较佳地，所述步骤S16包括：S161：将所述步骤S11至步骤S14的信息及数据录入所述检测平台中，建立可供检索的操作记录和细胞信息档案；S162：对所述检测平台的环境及步骤S11至步骤S14中的设备数据进行监测，并在出现异常时进行报警本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S11：取人脐带进行安全性检测；S12：对人脐带进行分离纯化，得到人脐带间充质干细胞；所述步骤S12具体包括：S121：对人脐带进行消毒后，用冲洗液进行冲洗；S122：剪取冲洗后的人脐带的根部预设长度，去除血管和淤血后，用冲洗液进行冲洗；S123：将步骤S122得到的人脐带标本放置于培养瓶中，剪成预设大小的小块，加入培养基，混匀后进行离心，弃去上清，然后再进行离心，去除冲洗液残留；S124：将步骤S123中离心沉淀的组织块与培养基混匀后移入培养箱中进行培养；S13：对所述人脐带间充质干细胞进行扩增；S14：对所述人脐带间充质干细胞进行冻存。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S11：取人脐带进行安全性检测；S12：对人脐带进行分离纯化，得到人脐带间充质干细胞；所述步骤S12具体包括：S121：对人脐带进行消毒后，用冲洗液进行冲洗；S122：剪取冲洗后的人脐带的根部预设长度，去除血管和淤血后，用冲洗液进行冲洗；S123：将步骤S122得到的人脐带标本放置于培养瓶中，剪成预设大小的小块，加入培养基，混匀后进行离心，弃去上清，然后再进行离心，去除冲洗液残留；S124：将步骤S123中离心沉淀的组织块与培养基混匀后移入培养箱中进行培养；S13：对所述人脐带间充质干细胞进行扩增；S14：对所述人脐带间充质干细胞进行冻存。2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤S124中的培养基为细胞无血清培养基。3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤S121中的冲洗液为D-Hank′s平衡盐溶液；和/或，所述步骤S122中的冲洗液为D-Hank′s平衡盐溶液。4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤S14具体包括：待所述人脐带间充质干细胞的融合率达到预设要求时，吸取预设容量的原培养液加入离心管留样，送至微生物免疫进行支原体检测，吸取预设容量的原培养液，送至微生物免疫进行细菌检测，离心前吸取两份预设容量的细胞悬液样本，一份使用流式细胞仪检测特征表面标记鉴定所得细胞为间充质干细胞，另一份送至微生物免疫进行TP53抑癌基因检测以及内毒素检测；离心后将沉淀细胞与细胞无血清冻存液混匀后移入冻存管进行冻存。5.根据权利要求4所述的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤S14中...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志国，任振辉，刘超，钮移坤，
申请(专利权)人：协和华东干细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33