间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基。该间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法，通过使用I型胶原酶和DNase I处理间充质干细胞组织，然后分离得到干细胞的单细胞悬液和未完全消化的组织块，分别接种，使用无血清干细胞培养基进行大规模干细胞的扩大培养，扩增结束后使用干细胞冻存保护剂进行液氮冻存。与传统方法相比，上述间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法对整个干细胞组织的利用率更高，且细胞活力更高；使用无血清培养方法可以有效降低血清对干细胞后续应用的影响；使用高效的冻存保护剂，价格便宜，细胞活率高，可现配现用，简单可行。

Isolation and culture of mesenchymal stem cells and corresponding preservation methods and serum-free medium

The invention discloses a method for isolating and culturing mesenchymal stem cells and a corresponding preservation method and a serum-free medium. The method of isolation and culture of mesenchymal stem cells and the corresponding preservation method were used. Mesenchymal stem cells were treated with type I collagenase and DNase I. Then single cell suspension and undigested tissue blocks of stem cells were isolated and inoculated, respectively. Large-scale stem cells were cultured in serum-free stem cell culture medium. After the expansion, cryopreservation of stem cells was used. The agent was frozen in liquid nitrogen. Compared with the traditional methods, the above-mentioned methods of isolation and culture of mesenchymal stem cells and the corresponding preservation methods have higher utilization rate of the whole stem cell tissue and higher cell viability; serum-free culture method can effectively reduce the impact of serum on the follow-up application of stem cells; the use of efficient cryoprotectants is cheap, high cell viability, ready-to-use, simple and feasible.

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基
本专利技术涉及细胞工程
，尤其是涉及一种间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基。
技术介绍
间充质干细胞来源于多种组织(如骨髓组织、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等)，是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞。间充质干细胞可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，如在心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面也具有长远的发展前景。现阶段的间充质干细胞主要来源于骨髓、脐带和胎盘。相对于骨髓间充质干细胞，脐带和胎盘来源的间充质干细胞更原始，有更强的增殖分化能力；而且脐带和胎盘来源的干细胞纯度高，无肿瘤细胞污染，扩增时培养体系能统一，便于质控；此外，获取方便，易于保存和运输，伦理学争议少。胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。然而现在我国脐带或胎盘等间充质干细胞普遍存在实验室小规模制备、扩增效果不高、细胞活力较低的问题。间充质干细胞的分离培养方法一般都是组织剪碎后直接贴壁培养的方法，或者是胰酶消化后接种培养的方法。这两种方法细胞的得率都较低，而且胰酶消化会影响细胞的活力。现在间充质干细胞一般传代扩增时用的都是含血清的培养基，血清残留会影响后续间充质干细胞的临床应用。另外，由于间充质干细胞临床应用所需的细胞数量较大，临床应用常需要达到108～1010数量级，这种规模的细胞数量在实验室中常规使用培养瓶扩增，耗材消耗量大，人力成本也很高。国外也有机构使用生物反应器进行干细胞大规模扩增，但是通常生物反应器用于悬浮细胞的大规模扩增，而且是开放式系统，需要很多支持设备，不但操作复杂，还容易导致污染等问题，临床应用也存在相当大的风险。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基，以解决传统的间充质干细胞分离培养过程中存在规模小、操作复杂的问题。本专利技术解决所述技术问题的技术方案如下。一种间充质干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：向间充质干细胞组织中加入I型胶原酶溶液和DNaseI溶液；将所述间充质干细胞组织切碎，过滤分离，分别收集干细胞消化液和未完全消化的组织块；洗涤所述干细胞消化液并离心，收集干细胞的单细胞沉淀；分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养。在其中一个实施例中，所述I型胶原酶溶液是用DPBS缓冲液配制的I型胶原酶终浓度为0.10PZU/ml～0.15PZU/ml的溶液。在其中一个实施例中，所述DNaseI溶液的中DNaseI的浓度是18000U/ml～23000U/ml。在其中一个实施例中，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。在其中一个实施例中，所述无血清基础培养基是UltraCULTURE无血清培养基，所述血清替代物是UltraGROTM血清替代物。在其中一个实施例中，所述分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养包括：分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于添加有无血清培养基的容器中进行原代培养；待原代培养的容器中细胞融合度达到75％～85％时，使用无胰酶的消化液消化细胞，离心去上清后，接种于多层细胞培养器中进行传代扩大培养。在其中一个实施例中，在原代培养时，所述干细胞的单细胞沉淀是按照(4.5～5.5)×103个细胞/cm2的接种密度接种，所述未完全消化的组织块是按照每75cm2的接种培养面积添加0.15～0.25g组织块的接种密度接种；在所述多层细胞培养器中进行扩大培养时，是将原代培养细胞按照(4.5～5.5)×103个细胞/cm2的接种密度接种。一种间充质干细胞的保存方法，包括如下步骤：向上述任一实施例所述的间充质干细胞的分离培养方法分离培养得到的间充质干细胞的传代培养细胞中添加冻存保护剂，进行液氮冷冻存储；所述冻存保护剂含有如下体积份数的各组分：10～12份的DMSO、0.5～1.5份的右旋糖酐-40、7～9份的注射用水、30～40份的无血清基础培养基、40～50份的白蛋白含量为20wt％的人血白蛋白注射液。在其中一个实施例中，所述传代培养细胞是第5代的传代培养细胞。一种无血清培养基，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。上述间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法，通过使用I型胶原酶和DNaseI处理间充质干细胞组织，然后分离得到干细胞的单细胞悬液和未完全消化的组织块，分别接种，使用无血清干细胞培养基进行大规模干细胞的扩大培养，扩增结束后使用干细胞冻存保护剂进行液氮冻存。该间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法操作简单，充分利用获取的间充质干细胞组织，操作过程安全有效。与传统方法相比，上述间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法对整个干细胞组织的利用率更高；用胶原酶或胰酶替代物来代替胰酶消化，使得细胞活力更高；使用无血清培养方法可以有效降低血清对干细胞后续应用的影响，安全、活率高、得率高、扩增速率快，简便可行；后续可以配合使用细胞工厂进行大规模培养，所得的间充质干细胞数量更多；使用高效的冻存保护剂，价格便宜，细胞活率高，可现配现用，简单可行。附图说明图1为常规的胰酶消化法或组织块贴壁法与使用实施例1方法所得的干细胞数量的比较结果。图2为胰酶替代物Tryple消化的干细胞活率与胰酶消化的干细胞活率的比较结果。图3为使用实施例2的干细胞无血清培养基进行干细胞扩增，干细胞扩增效率与其他培养基的比较结果。图4为使用实施例3的干细胞冻存保护剂，冻存的干细胞活率与其他冻存液的比较结果。图5a和图5b分别为实施例3中干细胞单细胞悬液扩增所得的P5代细胞与干细胞组织块扩增所得的P5’代细胞，经流式细胞仪所测的细胞表型比较。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：向间充质干细胞组织中加入I型胶原酶溶液和DNase I溶液；将所述间充质干细胞组织切碎，过滤分离，分别收集干细胞消化液和未完全消化的组织块；洗涤所述干细胞消化液并离心，收集干细胞的单细胞沉淀；分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：向间充质干细胞组织中加入I型胶原酶溶液和DNaseI溶液；将所述间充质干细胞组织切碎，过滤分离，分别收集干细胞消化液和未完全消化的组织块；洗涤所述干细胞消化液并离心，收集干细胞的单细胞沉淀；分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养。2.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶溶液是用DPBS缓冲液配制的I型胶原酶终浓度为0.10PZU/ml～0.15PZU/ml的溶液。3.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述DNaseI溶液的中DNaseI的浓度是18000U/ml～23000U/ml。4.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。5.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述无血清基础培养基是UltraCULTURE无血清培养基，所述血清替代物是UltraGROTM血清替代物。6.如权利要求1～5中任一项所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养包括：分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海涛，沈政，列浦昌，聂惠蓉，黄春艳，施念，
申请(专利权)人：北昊干细胞与再生医学研究院有限公司，冠昊生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44