人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法技术

本发明专利技术提供了人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，属于干细胞技术领域。本发明专利技术提供的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，通过酶处理得到脂肪垫细胞，表型鉴定后通过诱导培养，进行对细胞的干性的鉴定，得到人髌前脂肪垫干细胞，满足干细胞的相关特性，未来可作为细胞模型应用于多种不同实验。

Isolation and Identification of Human Prepatellar Adipose Pad Stem Cells

The invention provides a method for isolation and identification of human pre-patellar fat pad stem cells, which belongs to the technical field of stem cells. The method for isolation and identification of human pre-patellar adipose pad stem cells provided by the invention obtains adipose pad cells by enzymatic treatment, identifies their phenotype, identifies their dryness through induction culture, obtains human pre-patellar adipose pad stem cells, satisfies the relevant characteristics of stem cells, and can be used in various experiments as cell models in the future.

【技术实现步骤摘要】
人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法
本专利技术涉及干细胞
，具体而言，涉及人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells)因具有强大的自我更新、多向分化及跨胚层发育的可塑性，在组织工程的构建及基因治疗方面具有巨大的发展潜力。目前对髌前脂肪垫干细胞的研究好较少，对脂肪垫干细胞的分离、培养和鉴定方法还不够完善，因此脂肪垫干细胞不能作为细胞模型进行科学研究，所以需要尽快的发展脂肪垫干细胞的分离、培养和鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，提供一种稳定可靠的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，验证脂肪垫干细胞的可靠性。为了实现本专利技术的上述目的，采用以下技术方案：人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，分离鉴定方法包括以下步骤：将人髌前脂肪垫组织用酶液消化、过滤和离心得到脂肪垫细胞；将脂肪垫细胞接种于培养皿进行培养，脂肪垫细胞覆盖培养皿达到76％-82％时，用酶消化并计数，得到酶消化细胞；将酶消化细胞接种于培养基，培养并计数，得到脂肪垫干细胞并流式进行表型鉴定和诱导培养鉴定分析。与现有技术相比较，本专利技术的有益效果包括：本专利技术提供的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，通过酶处理得到脂肪垫细胞，表型鉴定后通过诱导培养，进行对细胞的干性的鉴定，得到人髌前脂肪垫干细胞，满足干细胞的相关特性，未来可作为细胞模型应用于多种不同实验。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实验例提供的脂肪垫干细胞显微结果示意图；图2为本专利技术实验例提供的细胞生长曲线结果图；图3为本专利技术实验例提供的流式表型分析图；图4为本专利技术实验例提供的流式表型分析图；图5为本专利技术实验例提供的流式表型分析图；图6为本专利技术实验例提供的CD19和CD44标记的流式表型分析图；图7为本专利技术实验例提供的CD73和CD90标记的流式表型分析图；图8为本专利技术实验例提供的CD105和anti-HLA-DR标记的流式表型分析图；图9为本专利技术实验例提供的CD11b和CD45标记的流式表型分析图；图10为本专利技术实验例提供的CD29和CD34标记的流式表型分析图；图11为本专利技术实验例提供的CD71标记的流式表型分析图；图12为本专利技术实验例提供的成骨分化显微结果示意图；图13为本专利技术实验例提供的成脂分化显微结果示意图；图14为本专利技术实验例提供的成软骨分化显微结果示意图；图15为本专利技术实验例提供的细胞微尺度生长状况显微示意图；图16为本专利技术实验例提供的成骨基因表达示意图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法进行具体说明。干细胞按照来源不同，分为：骨髓来源干细胞；滑膜来源干细胞；脂肪来源干细胞；外周血来源干细胞；肌肉来源干细胞；脐带血来源干细胞；皮肤来源干细胞；骨膜来源干细胞；肌腱来源干细胞以及髌下脂肪垫来源的干细胞，不同来源干细胞具备各自的优缺点。人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，分离鉴定方法包括以下步骤：将人髌前脂肪垫组织用酶液消化、过滤和离心得到脂肪垫细胞；将脂肪垫细胞接种于培养皿进行培养，脂肪垫细胞覆盖培养皿达到76％-82％时，用酶消化并计数，得到酶消化细胞；将酶消化细胞接种于培养基，培养并计数，得到脂肪垫干细胞并流式进行表型鉴定和诱导培养鉴定分析。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，酶液为0.1％的I型胶原酶液。通过选用I型胶原酶液的处理，细胞间的结缔组织被酶液分解，就可以使得细胞游离出来，有利于进一步的对细胞的处理，而且游离出来的细胞具有更大的与培养基接触的比面积，更容易进行增殖生长，获得更多的细胞。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，过滤选用80-140目筛进行。通过过滤，能将未被消化的大块的髌下脂肪垫样品过滤掉，有利于实验的进行。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，离心的转速为1300rpm，时间为6min。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，脂肪垫细胞覆盖培养皿达到76％-82％前，包括更换培养基，在接种脂肪垫细胞后22-27h更换培养基，然后每三天更换一次培养基。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，酶为胰酶。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，酶消化细胞的接种密度为3×103-7×103个/接种孔。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，流式表型鉴定包括将脂肪垫干细胞稀释分装于添加有表面分子标记的流式管，然后加入荧光抗体混合，避光孵育，加入PBS缓冲液混合后离心取上清，重新加入PBS缓冲液重悬并流式分析。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，流式表型鉴定包括将脂肪垫干细胞稀释分装于添加有表面分子标记的流式管，然后加入荧光抗体混合，避光孵育，加入PBS缓冲液混合后离心取上清，重新加入PBS缓冲液重悬并流式分析。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，表面分子标记CD11b-PE-cy5、CD19-FITC、CD29-APC、CD34-APC、CD44-FITC、CD45-PE-cy5、CD71-APC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE和HLA-DR-PE。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，诱导培养鉴定分析包括成骨诱导及茜素红染色分析、成脂诱导及油红染色分析、成软骨诱导及阿利辛蓝染色分析以及成骨诱导基因的表达分析。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，包括以下步骤：1.1取人髌下脂肪垫组织用0.1％的I型胶原酶消化；1.2用80目的过滤筛过滤后以1300rpm的转速离心5min，得到脂肪垫细胞；1.3脂肪垫细胞接种于培养皿中，并在37℃恒温、5％的CO2、95％湿度的细胞培养箱中培养；1.4放入培养箱后24h更换培养基，然后每镉3天更换培养基；1.5当脂肪垫细胞覆盖培养皿76％时；用胰酶进行消化得到酶消化细胞并计数；1.6将酶消化细胞以3×103个/接种孔的密度接种在24孔培养板中，且每孔添加0.5mL培养液，于37℃恒温、5％的CO2、95％湿度的细胞培养箱中培养；1.7培养24h后开始计数，每天取3个复孔分别消化并计数；1.8未消化的细胞每3天全量换液一次，连续计数7天，制作生长曲线。1.9得到脂肪垫干细胞可以进行流式表型鉴定，并用诱导培养基进行诱导培养脂肪垫干细胞，然后并进行鉴定分析。诱导培养鉴定分析包括成骨诱导及茜素红染色分析、成脂诱导及油红染色分析、成软骨诱导及阿利辛蓝染色分析以及成骨诱导基因的表达分析。流式细胞分析的方法包括以下步骤：2.1用胰蛋白酶消化脂肪垫干细胞，并用PBS缓冲液稀释到浓度为5×105个/mL，用12个流式管分装，每个管添加1mL的细胞液；2.2在12个流式管中的11个流本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，其特征在于，所述分离鉴定方法包括以下步骤：将人髌前脂肪垫组织用酶液消化、过滤和离心得到脂肪垫细胞；将所述脂肪垫细胞接种于培养皿进行培养，所述脂肪垫细胞覆盖所述培养皿达到76％‑82％时，用酶消化并计数，得到酶消化细胞；将所述酶消化细胞接种于培养基，培养并计数，得到脂肪垫干细胞并进行流式表型鉴定；用诱导培养基诱导培养所述脂肪垫干细胞，并进行鉴定分析。

【技术特征摘要】
1.人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，其特征在于，所述分离鉴定方法包括以下步骤：将人髌前脂肪垫组织用酶液消化、过滤和离心得到脂肪垫细胞；将所述脂肪垫细胞接种于培养皿进行培养，所述脂肪垫细胞覆盖所述培养皿达到76％-82％时，用酶消化并计数，得到酶消化细胞；将所述酶消化细胞接种于培养基，培养并计数，得到脂肪垫干细胞并进行流式表型鉴定；用诱导培养基诱导培养所述脂肪垫干细胞，并进行鉴定分析。2.根据权利要求1所述的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，其特征在于，所述酶液为0.1％的I型胶原酶液。3.根据权利要求1所述的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，其特征在于，所述过滤选用80-140目筛进行。4.根据权利要求1所述的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，其特征在于，所述离心的转速为1300rpm，时间为5-8min。5.根据权利要求1所述的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，其特征在于，所述脂肪垫细胞覆盖所述培养皿达到76％-82％前，包括更换培养基，在接种所述脂肪垫细胞后22-27h更换培养基，然后每三天更换一次培养基。6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，朱园园，向川，赵斌，
申请(专利权)人：山西医科大学第二医院，
类型：发明
国别省市：山西,14