一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，所述的方法包括如下步骤：无血清的间充质干细胞的上清液的收集：首先进行间充质干细胞的培养，更换培养基培养，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；取所述初始上清液在进一步梯度离心，将所述离心后的上清液转移到无菌离心管中，离心，收集到含有微囊泡的上清液；将含有微囊泡的上清液离心，得到含有外泌体的沉淀，清洗，然后再离心，得到外泌体沉淀；将得到的外泌体沉淀，加入无菌PBS，过滤，得到所述的特异性的间充质干细胞外泌体。本发明专利技术收集的外泌体采用过滤膜过滤，可以确保提取的外泌体为纳米级；同时降低并优化了转速，减少了高速的机械损伤，分离效率高，成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法
本专利技术属于细胞
，具体涉及一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法。
技术介绍
间充质干细胞(Mesenchyamlstemcells,MSCs)是一类多能干细胞，它源于发育早期的中胚层和外胚层，可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和脐带等多种组织中分离，经诱导后可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经肝、心肌和内皮等多种组织细胞。过去，常常认为间充质干细胞可巢居到受损部位后直接定向分化为靶细胞来发挥作用。然而，有研究表明，间充质干细胞巢居到损伤部位的比例和分化为靶细胞的数量都是非常有限的，而且分化为所需靶细胞的这一过程非常短暂，与观察到的治疗效果在时间上互相矛盾。因此，越来越多的研究倾向于认为间充质干细胞主要通过旁分泌机制来分泌多种细胞因子作用于其他细胞来发挥作用。外泌体(Exosome,Exo)作为旁分泌的一个重要组成部分，它是由各种活体细胞分泌的大小约为30～100nm之间，密度在1.13～1.19g/ml之间的脂质双层膜囊泡状结构小体，与质膜融合后，以胞吐形式释放到细胞外环境中。当外泌体与靶细胞接触后，外泌体及其携带的生物分子(如功能性的脂类、蛋白质，信使RNAs(mRNAs)、microRNAs等分子)以胞吞的形式被接收并发挥作用。因此，大量的研究也发现间充质干细胞确实可以通过自身的外泌体发挥与细胞相类似的组织修复、免疫抑制调节免疫功能等作用。如早在2007年，Timmer等团结就发现，MSC的细胞外基质可以有效地减轻缺血再灌注损伤，通过猪的心脏缺血/再灌注模型给予MSC的细胞外基时质处理，可以减少心脏梗死面积达将近60％。通过对细胞外基质内在活性物质的研究分析，电镜观察到是一群大小在50～200nm间的脂质双分子囊泡，并且特异性表达CD81、CD9、ALIX等蛋白，基本符合外泌体的基本特性。除此之外，在肾损伤修复方面，有人通过5/6肾全切构建小鼠慢性肾损伤模型时，分别给与30ug间充质干细胞外泌体和1×106间充质干细胞，通过尾静脉注射处理，7天后解剖显示,与给予PBS的空白对照组相比，间充质干细胞处理组和间充质干细胞外泌体处理组的小鼠血尿素氮、血肌酐、尿酸比例都出现减少，改善了组织纤维化和间质淋巴细胞浸润现象。这些均证实，间充质干细胞确实可通过分泌外泌体发挥旁分泌功能。并且与细胞治疗相比较，外泌体性质更稳定，保存运输方便，没有移植细胞带来的免疫排斥反应和肿瘤形成风险，因此这种“无细胞的外泌体”有望成为一种新的治疗策略。如何获得分离外泌体并获得高纯度的外泌体是当前科研工作者及其关注的问题，它对后续的应用研究至关重要。因此，本专利针对此问题专利技术一种可收集高浓度的、特异性的间充质干细胞来源的外泌体。目前，外泌体的分离提取方法主要有：超速离心、免疫磁珠、超滤法、沉淀或试剂盒等方法。这些方法具体如下：1、超速离心法(差速离心法)：超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行:即细胞培养上清液在300g，10min离心，沉淀，取细胞上清液；2000g离心10min去除死细胞沉淀，取上清液；再接着1000g，30min分离，沉淀，去除细胞碎片沉淀物，获得的上清在＞10000g，70min分离条件下，获得的沉淀为外泌体沉淀和其他干扰蛋白质，最后将这些沉淀再次用PBS洗涤，在＞100000g离心70min，沉淀即可得到外泌体。超速离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。2、密度梯度离心：该方法是将样本和不同蔗糖密度材料混合在一起离心。在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，以致使样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，形成一种区带进而分离的方法。如实验中常用蔗糖密度梯度离心法是预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5M和0.25M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100000g离心16h，外泌体会沉降到等密度区(1.10～1.18g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。在干细胞来源的外泌体提取相关专利未见报道。3、超滤离心：由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。申请号为201710447410.4的中国专利公开了干细胞外泌体的分离方法，他们通过联合运用不同大小的浓缩管可以快速收集干细胞外泌体。即：通过对无菌的外泌体分别采用10KD超滤管进行4℃，3500～4500g离心35～45min后，将获得的浓缩液，再次将用新的10KD超滤管在常温条件下再次离心，条件为150000g，8～12min,收集浓缩液；最后则常温条件下(15～30℃)进一步采用900～1100g离心1.5～2.5min，收集管中获得的液体则为含高浓度干细胞外泌体的溶液。他们表明，他们提供的分离法法离心时间比超速离心时间短，可有效减少外泌体的机械损伤，更好的保留外泌体的活性。4、磁珠免疫法：外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。5、PEG-base沉淀法：聚乙二醇(PEG)可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。6、试剂盒提取：近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。虽然这些方法各有其特点，但是磁珠免疫法、PEG-base沉淀法和试剂盒提取方法仅适用小样本的外泌体提取，并不适用于大规模外泌体的收集。而蔗糖梯度离心的方法又相对费时，超滤离心需要不断更换滤膜。另外，这些方案均未针对各类样品进行特异性外泌体的分离优化。因此本方案主要针对最常见的、适于分离、提取间充质干细胞来源的外泌体的超速离心法进行优化，专利技术出一种适用于间充质干细胞并能分离出特异性外泌体的分离提取方法。如上所述，超速离心法简单来说将细胞培养液或体液等样本依次在300g、2000g、10000g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100000g离心得到外泌体。申请号为201610279473.9的中国专利公开了一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用，公开了白介素-1β(IL-1β)优化的脐带间充质干细胞来源外泌体在治疗脓毒症中的应用时，外泌体收集和分离提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：(1)无血清的间充质干细胞的上清液的收集：首先进行间充质干细胞的培养，将细胞融合度达到60‑70％的间充质干细胞，用PBS清洗，更换成无血清相关成分的培养基进行培养，待细胞长满平底，收集培养基，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；(2)取所述初始上清液在进一步梯度离心2000g离心10min，除去死细胞和大的碎片，得到离心后的上清液；(3)将所述离心后的上清液转移到离心管中，在10000g离心30min，收集到含有微囊泡的上清液；(4)将含有微囊泡的上清液在70000g离心60min，得到含有外泌体的沉淀，清洗，然后再70000g离心70min，得到外泌体沉淀；(5)将得到的外泌体沉淀加入PBS，用过滤膜过滤，得到所述的特异性的间充质干细胞外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：(1)无血清的间充质干细胞的上清液的收集：首先进行间充质干细胞的培养，将细胞融合度达到60-70％的间充质干细胞，用PBS清洗，更换成无血清相关成分的培养基进行培养，待细胞长满平底，收集培养基，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；(2)取所述初始上清液在进一步梯度离心2000g离心10min，除去死细胞和大的碎片，得到离心后的上清液；(3)将所述离心后的上清液转移到离心管中，在10000g离心30min，收集到含有微囊泡的上清液；(4)将含有微囊泡的上清液在70000g离心60min，得到含有外泌体的沉淀，清洗，然后再70000g离心70min，得到外泌体沉淀；(5)将得到的外泌体沉淀加入PBS，用过滤膜过滤，得到所述的特异性的间充质干细胞外泌体。2.根据权利要求1所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤(1)中培养间充质干细胞的培养基为浓度为5％的PLA的ɑ-MEM培养基或为浓度为15％的FBS的ɑ-MEM培养基。3.根据权利要求2所述的一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏志璋，黃馨萍，
申请(专利权)人：深圳市浊安认证生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44