人脐带间充质干细胞培养方法及其成软骨分化的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种人脐带间充质干细胞培养方法及其成软骨分化的培养方法，所述培养方法为对人脐带间充质干细胞的培养给予低强度脉冲超声刺激。由本发明专利技术所提供的培养方法均能在同等对比培养条件下，提高细胞的增殖率。本发明专利技术建立了人hUC‑MSCs体外培养及成软骨分化培养方法为软骨组织工程中体外应用生物反应器大规模扩增培养软骨种子细胞提供力学依据，并为进一步研究应力加载下人脐带间充质干细胞成软骨分化中的力学信号转导机制提供基础。

Culture methods of human umbilical cord mesenchymal stem cells and their chondrogenic differentiation

The present invention relates to a culture method of human umbilical cord mesenchymal stem cells and a culture method of chondrogenic differentiation. The culture method provides low intensity pulsed ultrasound stimulation for the culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The culture method provided by the invention can improve the cell proliferation rate under the same contrast culture conditions. The present invention establishes a method for in vitro culture and chondrogenic differentiation of human hUC MSCs, which provides a mechanical basis for large-scale expansion and culture of chondrocyte seed cells in vitro by Bioreactor in cartilage tissue engineering, and provides a basis for further research on the mechanism of mechanical signal transduction in chondrogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells under stress loading.

【技术实现步骤摘要】
人脐带间充质干细胞培养方法及其成软骨分化的培养方法
本专利技术属于干细胞培养
，涉及人脐带间充质干细胞培养方法及其成软骨分化的培养方法。
技术介绍
人脐带间充质干细胞(Humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，其成集落生长潜能及成骨时间早于骨髓等其他来源间充质干细胞。关节软骨损伤是一种由创伤或过度活动等原因导致的关节疾病，是人类面临的主要运动性疾病之一。软骨损伤后，如不经治疗，随着受损面积和深度的增加，大多会出现关节疼痛、肿胀、畸形及功能障碍等症状，并最终导致骨性关节炎的发生，严重影响生活质量，并给患者个人、家庭和社会带来巨大经济负担。有文献报道关节软骨损伤发生率约为5％，对于某些特定人群如运动员发生率则高达22％-50％。随着世界人口老龄化加剧，关节软骨损伤发病率正日益增加，与之相关的医疗费用、社会生产力损失及额外经济负担也随之增加。关节软骨损伤的修复已成为近年来医学基础研究的一个重要领域。由于关节软骨损伤后不易修复,决定了关节软骨损伤的修复是热点中的难点，软骨移植、软骨细胞移植、组织工程技术及凝胶类关节软骨修复材料是目前对关节软骨损伤进行修复的主要手段。目前，组织工程构建的工程软骨存在许多不足。有研究发现和正常软骨相比，工程软骨浅层缺少胶原纤维结构，表面刚度和保水能力都较低。而且软骨组织工程中存在如何获取足够数量的种子细胞以及优化组织工程软骨性能的问题。经过二十多年的发展，软骨组织工程学以骨髓间充质干细胞(BMSCs)和关节软骨细胞为种子细胞的研究已渐趋成熟，目前均有成功运用其修复关节软骨缺损的临床报道。如果选择人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)作为研究对象，其来源广泛，取材方便，具有多向分化潜能，比BMSCs具有更强的增殖能力、较低的HLA-ABC和HLA-DR表达，更好的粘附性和成软骨分化特性，是理想的软骨组织工程种子细胞。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种提高细胞增殖率的人脐带间充质干细胞的培养方法，目的之二在于提供一种人脐带间充质干细胞成软骨分化并有所增殖的培养方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.一种人脐带间充质干细胞的培养方法，所述培养方法为对人脐带间充质干细胞的培养给予低强度脉冲超声刺激。进一步，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，30-50mW/cm2。进一步，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，50mW/cm2。进一步，人脐带间充质干细胞培养的培养基为DMEM培养基含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺以及1％50U/mL青、链霉素。2.一种人脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，将人脐带间充质干细胞在软骨诱导液培养下给予低强度脉冲超声刺激。进一步，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，≤30mW/cm2。进一步，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，30mW/cm2。进一步，先将人脐带间充质干细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养至细胞融合至60-80％，更换软骨诱导液培养，再进行低强度脉冲超声刺激。以上任一项所述的人脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法中，所述软骨诱导液为DMEM培养基含100nmol/L地塞米松、1％ITS、10ng/LTGF-β、50mg/mL抗坏血酸、40mg/mL脯氨酸、100mg/mL丙酮酸钠、10％胎牛血清。本专利技术的有益效果在于：本专利技术建立了人hUC-MSCs体外培养及成软骨分化培养方法，体外应用低强度脉冲超声波发生装置(LIPUS)对培养人脐带间充质干细胞进行应力加载，筛选出促进人脐带间充质干细胞增殖、成软骨分化的最适宜的LIPUS加载强度和时间参数，并探讨LIPUS应力加载对人脐带MSCs的增殖和成软骨分化生物学特的影响，为软骨组织工程中体外应用生物反应器大规模扩增培养软骨种子细胞提供力学依据，并为进一步研究应力加载下人脐带间充质干细胞成软骨分化中的力学信号转导机制提供基础。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为SonaCell超声设备；图2为P2代hUCMSCs培养4h后贴壁细胞图；图3为hUCMSCs培养4-5d后贴壁细胞图；图4为LIPUS刺激下hUCMSCs培养10天时细胞图；图5为LIPUS刺激和成软骨诱导培养7d的细胞图；图6为5min/dLIPUS刺激培养5d时，各实验组细胞图；图7为不同刺激时间，不同刺激强度下各实验组细胞增殖率柱状图；图8为不同刺激时间，不同刺激强度下并成软骨诱导培养2周时各实验组细胞图；图9为复合诱导组中各实验组COL2A1和GAG浓度柱状图；图10为复合诱导组中各实验组细胞阿利新蓝染色图；图11为复合诱导组中各实验组细胞COL2A1细胞免疫荧光；图12为复合诱导组中各实验组细胞COL2A1细胞免疫+DAPI染色结果。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本专利技术所用的低强度脉冲超声(Lowintensitypulsedultrasound，LIPUS)由SonaCell超声设备提供。SonaCell超声设备(加拿大Intelligent-Nano公司)是基于生物学和临床研究的基础上设置的。hUCMSCs细胞(人脐带间充质干细胞，购自广州赛业生物科技有限公司，货号HUXUC-01001)。细胞培养基为脐带间充质干细胞完全培养基(购自广州赛业生物科技有限公司，货号HUXUC-90011，DMEM培养基含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺以及1％50U/mL青、链霉素)。脐带间充质干细胞成软骨诱导分化完全培养基(购自广州赛业生物科技有限公司，货号HUXUC-90041)。实施例1SonaCell超声设备参数：声波频率(ultrasoundfrequency)＝1.5MHz，脉冲重复频率(pulserepetitionrate)＝1KHz，占空比(pulsedutycycle)＝20％，输出超声强度范围为0～100mW/cm2。如图1所示，低强度脉冲超声加载装置上的4个探头元件分别对应12孔细胞培养板的A1、B2、C1、C3位置，分别代表脉冲超声强度30mW/cm2、50mW/cm2、0mW/cm2、80mW/cm2。实验时超声探头通过耦合剂紧贴细胞培养板底部进行，脉冲超声刺激时间可控制调节。4个探头元件所输出的脉冲超声强度分别为0mW/cm2、30mW/cm2、50mW/cm2、80mW/cm2。实验分为4组：对照组(C组，输出超声强度0mW/cm2)、LIPUS刺激L30组(输出超声强度30mW/cm2)、L50组(输出超声强度50mW/cm2)、L80组(输出超声强度80mW/cm2)，每组做4组重复实验。实验时超声探头本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法为对人脐带间充质干细胞的培养给予低强度脉冲超声刺激。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法为对人脐带间充质干细胞的培养给予低强度脉冲超声刺激。2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，30-50mW/cm2。3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述低强度脉冲超声刺激强度为每天5分钟，50mW/cm2。4.根据权利要求1-3任一项所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，人脐带间充质干细胞培养的培养基为DMEM培养基含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺以及1％50U/mL青、链霉素。5.一种人脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，其特征在于，将人脐带间充质干细胞在软骨诱导液培养下给予低强度脉冲超声刺激。6.根据权利要求5所述的人脐带间充质...

【专利技术属性】
技术研发人员：金旭红，陈侠甫，车家驹，戴涛，
申请(专利权)人：海口市人民医院中南大学湘雅医学院附属海口医院，
类型：发明
国别省市：海南,46