一种具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：取健康成年的哺乳动物麻醉后，注射抗凝药物，打开腹腔选取小肠段，进行动、静脉血管插管固定并在近心端结扎离断血管。步骤二：夹闭小肠段的两端部，离断小肠段的两端部并分别插管固定，分离肠系膜，完整取下所需肠管及肠系膜血管，置于低温环境中，用生理盐水反复冲洗。步骤三：依次使用磷酸盐缓冲液、含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液、磷酸盐缓冲液分别灌注动脉、静脉、肠管。步骤四：灌注完成后消毒。本发明专利技术的方法制得的小肠脱细胞支架能够保留完整的支架结构。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，属于 生物
技术介绍
组织创伤或缺损是临床上常见的病症，如创伤引起的器官组织部分缺损，疝气、体 表皮肤损伤、烧伤等，严重影响病人的生活质量，是医学上必须面对和亟待解决的难题。目 前市场上用于组织修复的材料主要有两类：一类是聚丙烯、聚酯、聚四氟乙烯等高分子合成 材料，但因其都是细菌良好的粘附载体，细菌粘附于其上后即可产生使其免受宿主免疫防 御机制和抗生素作用的生物被膜，从而得以在局部长期成活并导致伤口的慢性感染，另外 其生物相容性不佳，细胞难以长入，无法达到有效的结构和功能重建；另一类是生物衍生材 料，由人的异体或哺乳类动物的膜状或者片状组织经理化处理而成的细胞外基质构成，其 在组织相容性、稳定性上较合成材料都有较为显著的改善，但是临床应用效果不明显。原因 是其制备过程破坏了天然的组织结构及其富含的生长因子等，从而延长组织修复时间或无 法达到长期的组织结构替代和功能替代的作用。因而，需要一种生物相容性良好、具备天然 组织的三维结构并且富含生长因子的支架材料来满足临床的需要。 理想的组织工程修复与支架材料应该具备如下的条件：1.有良好的生物相容性 和无抗原性，不会与受体发生免疫排斥反应；2.可降解性和降解速率可控性；3.维持生长 在其上的细胞形态和表型，并增进细胞的粘附和生长，诱导组织再生最终形成完整的生物 组织；4.有一定的空隙率便于组织间的营养和物质空气的交换；5.有一定的机械强度能够 对组织起到支持的作用。 目前关于小肠脱细胞支架的制备工艺过程简单，多局限在单独脱细胞上，总体来 说都会存在脱细胞或者消毒不充分的问题，从而导致材料存在一定的免疫原性和抗原性， 同时现有的技术多采用物理和化学联合方法处理小肠，以达到脱细胞去抗原的目的。文献 报道，物理和化学联合的方法处理小肠，能够完全去除小肠黏膜中的细胞成分，但同时也存 在不少的缺点，如现有技术中机械刮除方法可导致组织结构破坏，支架材料撕裂或破损，甚 至断裂，影响后续工艺进行，降低效率。而反复的化学处理可导致支架内的天然生长因子 丢失，从而影响细胞生长及组织再生。并且由于传统的方法得到的小肠脱细胞支架没有完 整的脉管网络，因此在进行大面积的组织修补时难以形成新生血管，修补的成功率低，效果 差。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架 制备方法。本专利技术所采用的技术方案如下： -种，其特征在于，包 括以下步骤： 步骤一：取健康成年的哺乳动物麻醉后，肌肉注射抗凝药物，打开腹腔选取一段血 供丰富的小肠段，分离小肠的肠系膜根部的动、静脉血管，进行动、静脉血管插管固定并在 近心端结扎离断血管； 步骤二：夹闭小肠段的两端部，离断小肠段的两端部并分别插管固定，分离肠系 膜，完整取下所需肠管及肠系膜血管，置于低温环境中，用生理盐水反复冲洗； 步骤三：依次使用磷酸盐缓冲液、含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲 液、十二烷基硫酸钠溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液、磷酸盐缓冲液分别灌 注动脉、静脉、肠管； 步骤四：灌注完成后使用过氧乙酸和乙醇混合液浸泡消毒，得到小肠脱细胞支架。 另外，本专利技术的，还 可以具有这样的特征：其中，步骤三中所有的PBS溶液的灌注时间为动脉、静脉、肠管各 30min，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌注速度为50-500ml/min。 另外，本专利技术的，还可 以具有这样的特征：其中，含乙二胺四乙酸的胰蛋白溶液的质量体积比为0. 25%，灌注时所 需温度为37°C，灌注时间为动脉、静脉、肠管各30min，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/ min，肠管的灌注速度为50-500ml/min。 另外，本专利技术的，还可 以具有这样的特征：其中，十二烷基硫酸钠溶液的质量体积比为0. 1%，肠管的灌注时间为8 小时，动脉和静脉的灌注时间均为4小时，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌 注速度为 50-500ml/min。 另外，本专利技术的，还可 以具有这样的特征：其中，聚乙二醇辛基苯基醚溶液的质量体积比为1%，PH值为11. 4,肠管 灌注时间为4小时，灌注速度为50-500ml/min，动脉和静脉的灌注时间分别为1小时，灌注 速度均为3_15ml/min。 另外，本专利技术的，还可 以具有这样的特征：其中，过氧乙酸和乙醇的混合液中过氧乙酸的终浓度为0. 1-0. 5% (V/ V)乙醇的终浓度为2-10% (V/V)，浸泡时间为3小时。 另外，本专利技术的，还可 以具有这样的特征：其中，哺乳动物为实验用哺乳动物大鼠、犬、猪、兔之中的任意一种。 另外，本专利技术的，还可 以具有这样的特征：其中，麻醉采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。 另外，本专利技术的，还可 以具有这样的特征：其中，抗凝药物为注射用低分子肝素，剂量为l〇〇〇U/kg。 专利技术作用与效果 根据本专利技术的，由于采 取了联合供应血管一同获取小肠，经脱细胞处理后即可获得具有完整脉管网络的小肠脱细 胞支架，具有完整的脉管网络可以使得在小肠脱细胞支架用于大面积修补的时候利于血管 的形成，从而保证大面积修补的成功率和修补效果。另一方面，由于采用了合适灌注流量 控制因此能够保持小肠脱细胞支架的完整性。另外，由于利用灌注法联合使用胰酶、SDS、 Triton脱细胞达到了在较短时间内对小肠进行整体脱细胞的效果，同时保留了小肠的完整 三维结构。【附图说明】 图1是本专利技术实施例二中大鼠小肠脱细胞支架电泳检测结果； 图2是本专利技术实施例二中的大鼠小肠脱细胞支架的HE染色示例图； 图3是施例二中大鼠小肠脱细胞支架的Masson染色图； 图4是施例二中大鼠小肠脱细胞支架粘膜面的扫描电镜图； 图5是实施例三中采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损及术后8周HE染 色结果； 图6是实施例三中采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损术后8周Masson 染色图； 图7CD31免疫荧光结果； 图8是本专利技术实施例三中采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损术后8周 CD3结果； 图9是本专利技术实施例三中采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损术后8周 ⑶68免疫组化结果； 图10是本专利技术实施例二中的生长因子VEGF的含量图； 图11是本专利技术实施例二中的生长因子b-FGF的含量图； 图12是本专利技术实施例二中的生长因子TGF-β的含量图；以及 图13是本专利技术实施例二中的体外成纤维细胞和支架共培养实验结果图。【具体实施方式】 实施方式中所使用的试剂的配方： 磷酸盐缓冲液（PBS溶液)，磷酸二氢钾（KH2P04)0. 2当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：取健康成年的哺乳动物麻醉后，肌肉注射抗凝药物，打开腹腔选取一段血供丰富的小肠段，分离所述小肠的肠系膜根部的动、静脉血管，进行动、静脉血管插管固定并在近心端结扎离断血管；步骤二：夹闭所述小肠段的两端部，离断所述小肠段的两端部并分别插管固定，分离肠系膜，完整取下所需肠管及肠系膜血管，置于低温环境中，用生理盐水反复冲洗；步骤三：依次使用磷酸盐缓冲液、含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液、磷酸盐缓冲液分别灌注动脉、静脉、肠管；步骤四：所述灌注完成后使用过氧乙酸和乙醇混合液浸泡消毒，得到小肠脱细胞支架。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周海洋，胡志前，张剑，张蓓蓓，孙延平，阮灿平，张言言，柴云笙，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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