重组抗体的再折叠方法技术

本发明专利技术一般涉及ＩｇＧ蛋白质的较佳型的富集或回收提高的制备方法。更具体地，本发明专利技术涉及使这种重组蛋白质制剂经受还原／氧化耦合剂和可选择地经受离液剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及提高蛋白质较佳型富集和/或回收的制备方法。更具体地说，本专利技术涉及重组抗体蛋白质的再折叠方法。
技术介绍
随着遗传工程时代的来临，带来了大量生物学相关多肽容易制备的前景，该多肽以功能型在遗传工程所得到的有机体内表达。在很多情况下，原核细胞用于重组蛋白的表达。然而，这个前景因为一些原因没有完全实现。例如，很多情况下，如果多肽业已在宿主细胞的胞质中生成并保留，则包函体会要求蛋白质的变性和复性，但经常只有部分或者很少成功。很多重要目的蛋白质在原核细胞中以可溶形式充其量无效表达，至少部分因为体内蛋白质折叠过程的复杂性(Houry等人，Nature，402147-154，1999)。从包函体内重新得到生物学上有活性的真核蛋白质需要在苛刻条件下的蛋白质伸展和再折叠，包括使用离液剂和还原性硫醇。在另一些情况下，表达的蛋白质或肽基本上降解，不仅导致产量低，而且生成难以分离和纯化的复杂混合物。体内蛋白质中二硫键形成是一个复杂的过程，由环境的氧化还原势和特定的硫醇-二硫化物交换酶决定(Creighton，Methods Enzymol.107，305-329，1984；Houee-Levin，Methods Enzymol.353，35-44，2002；Ritz and Beckwith，Roles ofthiol-redox pathways in bacteria，Annu.Rev.Microbiol.55，21-48，2001.)。二硫化物在细胞内新生链分泌到内质网的过程中或分泌之后很快形成(Creighton，MethodsEnzymol.107，305-329，1984)。因为缺少二硫化物形成过程，在不成对半胱氨酸残基的蛋白质结构或表面暴露中的三个或三个以上半胱氨酸残基非常接近，所以在哺乳动物细胞内的重组蛋白质形成过程中，可以产生同一蛋白质的一些构象异构体，但具有不同的二硫化物结构。一般来说，当蛋白质(包括抗体、IgG抗体、IgG1抗体和结合人IL-15的IgG1抗体)的半胱氨酸残基是折叠蛋白质区的一部分时，它们或者参与半胱氨酸-半胱氨酸二硫键或者空间上阻挡二硫键的形成。当某一半胱氨酸残基在蛋白质结构上没有配对，且在空间上没有因折叠而被阻挡，可以与溶液中的一自由半胱氨酸形成二硫键(半胱氨酰化)。该自由半胱氨酸残基通常与其它氨基酸作为蛋白质的基础结构在发酵培养基中存在。半胱氨酰化是药物蛋白质中不需要的翻译后修饰，可生成具有不需要的特性的构象异构体，如，结合力低、生物活性低和稳定性低。本专利技术提供一种方法去除半胱氨酰化，提高所需无半胱氨酰化的构象异构体的相对丰度。蛋白质中不成对的半胱氨酸残基可使之半胱氨酰化，这可导致蛋白质特性和功能显着变化。有报道在体内蛋白质进行蛋白质的半胱氨酰化(Craescu等人，J.Biol.Chem.261，14710-14716，1986；Dormann等人，J.Biol.Chem.1993，268，16286-16292；Davis等人，Biochemistry 1996，35，2482-2488；Lim等人，Anal.Biochem.2001，295，45-56.，Bondarenko等人，Int.J.Mass Spectrom.Ion Processes2002，219，671-680)。半胱氨酸残基的修饰调节蛋白质的活性。例如，谷胱甘肽与血色素共价结合增加这个蛋白质的氧结合力(Craescu等人，J.Biol.Chem.261，14710-14716，1986)。另一例中，肝型脂肪酸结合蛋白质(LABP)在半胱氨酰化和谷胱甘肽化后失去结合亲和力(Dormann等人，J.Biol.Chem.1993，268，16286-16292)。HIV-1蛋白酶活性通过半胱氨酰化和谷胱甘肽化调节(Davis等人，Biochemistry 1996，35，2482-2488)。据报道，在血液循环中有人抗体片段含有不成对的半胱氨酸。例如，某篇报道显示，免疫球蛋白的λ型轻链在位置33上有一自由半胱氨酸，所以轻链共有6个半胱氨酸残基(Buchwald等人，Can.J.Biochem.1971，49，900-902)。这表示这种自由半胱氨酸是λ轻链的亚组III的特性。尽管有报道在IgG分子中有不成对的半胱氨酸，还是有不成对半胱氨酸半胱氨酰化没有报道的情形。半胱氨酰化的检测在分析上难度很大，早期报道中半胱氨酰化检测失败可能因为在分析过程中的步骤之一中使用了还原(还原将消除半胱氨酰化)。当半胱氨酰化出现在CDR区域时，可以影响生物活性，如146B7所示，146B7是直接抗人IL-15的全长人抗体。通过再折叠消除半胱氨酰化有助于使异质性最小化，因此提高产物的同种性。通过再折叠消除半胱氨酰化也可以提高产物效率。半胱氨酰化将出现在含有一个或多个不成对半胱氨酸的其它IgG分子中，消除半胱氨酰化对这种产物的药物活性很重要。PCT出版的WO02/68455揭示了肿瘤坏死因子受体Fc融合蛋白的再折叠方法。该蛋白质通过将IgG1抗体的Fc区域与两种肿瘤坏死因子受体(TNFr)融合的生物工程方法而生成，而不是自然生成。该申请并没有提出蛋白质因至少一个自由或不成对半胱氨酸的存在，也就是说，没有参与二硫键形成的半胱氨酸而有异种结构。已知带有自由半胱氨酸的复杂蛋白质存在，至少一些免疫球蛋白是这种蛋白质在市场上销售的相关例子。具体地说，值得注意的是，WO02/68455没有提供自然生成如免疫球蛋白分子的方法的例子，也没有讨论或解决含有自由或不成对半胱氨酸的大而复杂的蛋白质的蛋白质折叠问题。微生物细胞产生的包函体蛋白质的体外再折叠(E.coli)在文献中详述，其包括两个步骤。首先，包函体蛋白质溶于高浓度的离液剂和还原剂中，以打断所有的二硫键(Middelberg，A.P.Preparative protein refolding.Trends Biotechnol.2002，20，437-443)。例如，在Rudolph，R.；Lilie，H.的综述中包函体溶解溶液包括6M盐酸胍和100mM DTT(In vitro folding of inclusion body proteins FASEB J.1996，10，49-56)。第二步是在适中浓度的盐酸胍(0.5-1.0M)和温和的氧化还原环境中进行蛋白质折叠(Middelberg，A.P.Preparative protein refolding.Trends Biotechnol.2002，20，437-443)。本专利技术不包括蛋白质完全变性的溶解步骤和在高浓度离液剂和还原剂参与下所有二硫键的还原。所述的专利技术方法不使蛋白质变性，或仅仅使它变性，以及仅仅还原/氧化(改组)少数几个二硫化物。本专利技术涉及在哺乳动物细胞中生产的蛋白质。哺乳动物细胞生产的蛋白质包括体内蛋白质折叠和二硫化物形成，而微生物细胞生产的蛋白质是高密度、未折叠、不溶蛋白质，与混合二硫化物(包函体)一起凝聚成团。因为哺乳动物细胞正确连接大部分二硫键，无需蛋白质完全变性和所有二硫键还原。US4766205认识到蛋白质重组生产受不适当形成的分子内二硫键妨碍，导致重组蛋白质的“非天然”构象被“冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＩｇＧ抗体制剂的制备方法，所述的方法包括以下步骤：　　　　使由哺乳动物细胞重组制备的纯化ＩｇＧ抗体制剂在ｐＨ大约为５至１１下与还原／氧化耦合剂接触；和　　　　使所述制剂在与所述还原／氧化耦合剂接触之前、之后或同时选择地进一步与离液剂接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T狄龙，D雷德尔，P邦达连科，M里奇，HS加吉尔，D班克斯，J周，吕越峰，
申请(专利权)人：埃姆艮股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]