用于生成抗体混合物的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或更多种不同抗体的混合物的方法。在一个实施方案中，生成了不同单价抗体的混合物不同。在另一个实施方案中，生成了单价和二价抗体的混合物。本发明专利技术还涉及通过本发明专利技术的方法可获得的抗体混合物及在本发明专利技术的方法中特别有用的轻链序列。

【技术实现步骤摘要】
用于生成抗体混合物的方法 本申请是中国申请201080013765.9的分案申请，该母案的国际申请日为2010年 1月26日，本分案采用了与该母案一致的专利技术名称。 专利
本专利技术提供了用于生成抗体混合物的方法、通过本专利技术的方法可获得的混合物及 此类混合物的用途，特别是在治疗癌症中的用途。本专利技术还涉及在本专利技术的方法中特别有 用的轻链。 专利技术背景 当前，有多种人类疾病是通过治疗性单克隆抗体，例如人源化的或完全人源的单 克隆抗体来治疗的。然而，一些疾病通过单克隆抗体不能充分有效地治疗，或者治疗效果随 单克隆抗体应用的时间而降低，例如由于靶物下调或致病途径的转换。因此，一种备选方案 可以是用多克隆抗体或抗体混合物来治疗。此类抗体混合物可包含两种或更多种针对同一 靶物上不同表位的抗体，或者，针对不同靶物的抗体的混合物。 US7262028记载了一种通过表达一种轻链和不同重链从单一宿主细胞克隆生成二 价抗体或二价抗体混合物的方法。US7262028中披露的专利技术提供了一种用于生成抗体组合 的方法，可以对该抗体组合筛选在多种应用中的有用性。 治疗性抗体的期望特征可依照要治疗的具体状况而变化。对于一些适应证，只需 要抗原结合，例如其中抗体的治疗效应是阻断抗原与一种或多种原本能够结合抗原的特定 分子之间的相互作用。对于其它适应证，可能还需要别的由抗体介导的效应，诸如诱导补体 活化、结合Fc受体等的能力。对于此类用途，抗体分子中抗原结合部分以外的部分诸如Fc 区可能是重要的。一些全长抗体在结合靶抗原时可展现激动效应（这可能被认为是不期望 的，特别是对于癌症治疗而言）。在一些情况下，此效应可归于通过二价抗体的交联;交 联促进二聚化，而二聚化可导致活化，尤其当靶物是受体时。在可溶性抗原的情况下，二 价革巴向性（bivalent targeting)可形成不期望的免疫复合物。因此，对于一些治疗性适应 证，单价抗体可能是优选的。 单价抗体的例子包括Fab片段、scFv抗体和纳米抗体。另一类包含一条重链和 一条轻链的单价抗体（UniBody?分子）已记载于W02007/059782、W0/2008/145137、 W0/2008/145138、W0/2008/145139和W0/2008/145140。在这些分子中，重链的序列已经被 修饰，使得不形成重链间键，从而不形成二价抗体。UniBody?分子的特征在于与Fab片 段相比有利的药动学。 需要改良的基于抗体的疗法，将使用多克隆抗体或抗体混合物的优点与单价抗原 结合的优点结合起来。本专利技术提供了用于生成单价抗体的混合物或单价和二价抗体的混合 物的方法。 专利技术概述 在第一个主要方面，本专利技术涉及一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或 更多种不同抗体的混合物的方法，包括在所述宿主细胞中表达： a)至少一种编码共同轻链的核酸构建体，和 b)两种或更多种编码重链的核酸构建体，所述两种或更多种核酸构建体包含 bl)编码两种或更多种不同第一重链的两种或更多种核酸构建体，其中所述各第 一重链的每个恒定区的氨基酸序列经过修饰，使得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH 区的其它区域，诸如CH3区，不含有任何能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时 与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基， 或 b2)至少一种编码第一重链的核酸构建体，其中恒定区的氨基酸序列经过修饰，使 得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域，诸如CH3区，不含有任何能够在 IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价 重链间键的氨基酸残基，和 至少一种核酸编码第二重链的构建体，所述第二重链能够在IVIG存在下或在施 用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键， 其中每种所述重链能够与所述轻链配对以形成功能性抗体。 因此，所述第一重链的序列经过修饰而不形成稳定的重链间键，并且由此所得抗 体是单价的（参见例如W02007/059782)。 因而，在备选方案bl的情况下，在同一细胞中生成不同单价抗体的混合物。此类 混合物可例如用于治疗疾病，特别是单克隆单价抗体和/或多克隆二价抗体的有效性不是 最好的疾病，如上文解释的。 在备选方案b2的情况下，在同一细胞中生成单价和二价抗体的混合物。此类混合 物可例如用于治疗疾病，诸如癌症。在一个特别有趣的实施方案中，所述单价抗体通过对靶 蛋白的拮抗性结合或阻断来抑制细胞增殖，且所述二价抗体结合另一种靶抗原，例如在同 一靶细胞上的，并募集效应器功能进行靶细胞杀伤。 在另一个主要方面，本专利技术涉及一种包含通过本专利技术的方法获得的或可获得的抗 体混合物的组合物，诸如药物组合物。 在另一个方面，本专利技术提供了一种适合依照上述方法用于生成抗体混合物的重组 宿主细胞。 本专利技术还提供了依照上述专利技术的组合物用于治疗疾病的用途。 本专利技术还公开了一种特别适合于在本专利技术中使用的共同轻链，因为它能替换各种 不同抗原特异性抗体的轻链而不损失特异性。此类轻链可更一般性地用于这样的含有抗体 产品的应用，其中将一种轻链与多种重链组合，诸如在重组多克隆或双特异性抗体中组合。 因此，在另一个方面，本专利技术涉及一种包含重链和轻链的重组抗体，其中所述轻链 包含SEQ ID NO :8所示的序列。 附图和序列表简述 图1。在ELISA中测量经转染的HEK-293F细胞的细胞培养物上清液中存在的单 价抗体对可溶性的带His标签的CD38的结合。单价Uni-005指示经单价Uni-005 (抗 CD38)构建体转染的HEK-293F细胞的上清液；单价组合指示表达Uni-7D8 (抗CD20)和 Uni-005的重链与抗⑶38抗体005的轻链的组合的细胞的上清液。 图2。在ELISA中测量经转染的HEK-293F细胞的细胞培养物上清液中存在的单 价抗体对一种抗HuMab-7D8的抗独特型抗体（其也结合Uni-7D8)的结合。单价Uni-7D8 指示经Uni-7D8构建体转染的HEK-293F细胞的上清液；单价组合指示表达Uni-7D8和 Uni-⑶38的重链与抗⑶38抗体005的轻链的组合的细胞的上清液。 图3 :对人K轻链种系文库筛选对各种重链的结合以鉴定共同轻链。在使用重组 可溶性抗原作为包被物的ELISA中筛选经瞬时转染的HEK-293F细胞的上清液的结合，其中 所述细胞表达带有对EGFr (A)、c-Met(B)或Her2 (C)特异性的可变域的铰链修饰（F273T、 Y275E)的重链，以及一条来自该文库的种系K轻链。每个点代表一种独特的重链和轻链组 合，并显示了结合（0D405)和表达（1:20稀释后的y g/mL)。形成功能性结合抗体的重链和 轻链组合标有1、2和3。（1'、2'和3'是该测定法中1、2和3的重复）。每项实验中用伴随 各重链的原来的K轻链作为阳性对照（矩形） 图4 :通过共表达和对重组靶物的结合ELISA对共同轻链的确认。在使用重组可 溶性抗原（分别为EGFR(A)、c-Met⑶或Her2(C))作为包被物的ELISA中，对经瞬时转染 的HEK-293F细胞的上清液筛选结合，其中所述细胞共表达三种分别带有对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或更多种不同抗体的混合物的方法，包括在所述宿主细胞中表达：a)至少一种编码共同轻链的核酸构建体，和b)两种或更多种编码重链的核酸构建体，所述两种或更多种核酸构建体包含b1)两种或更多种编码两种或更多种不同的第一重链的核酸构建体，其中所述第一重链的每个恒定区的氨基酸序列经过修饰，使得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域，诸如CH3区，不含有任何在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时能够与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基，或b2)至少一种编码第一重链的核酸构建体，其中恒定区的氨基酸序列经过修饰，使得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域，诸如CH3区，不含有任何能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基，和至少一种编码第二重链的核酸构建体，其中所述第二重链能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键，其中每种所述重链能够与所述轻链配对以形成功能性抗体。

【技术特征摘要】
2009.01.26 DK PA2009001181. 一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或更多种不同抗体的混合物的方法， 包括在所述宿主细胞中表达： a) 至少一种编码共同轻链的核酸构建体，和 b) 两种或更多种编码重链的核酸构建体，所述两种或更多种核酸构建体包含 bl)两种或更多种编码两种或更多种不同的第一重链的核酸构建体，其中所述第一重 链的每个恒定区的氨基酸序列经过修饰，使得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区 的其它区域，诸如CH3区，不含有任何在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时能够与 相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基， 或 b2)至少一种编码第一重链的核酸构建体，其中恒定区的氨基酸序列经过修饰，使得铰 链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域，诸如CH3区，不含有任何能够在IVIG 存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链 间键的氨基酸残基，和 至少一种编码第二重链的核酸构建体，其中所述第二重链能够在IVIG存在下或在施 用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键， 其中每种所述重链能够与所述轻链配对以形成功能性抗体。2. 依照权利要求1的方法，其中所述方法包括在所述宿主细胞中表达：两种或更多种 编码两种或更多种不同第一重链的核酸构建体，其中所述第一重链的每个恒定区的氨基酸 序列经过修饰，使得所述铰链区和如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域，诸如CH3 区，不含有任何能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫 键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基。3. 依照权利要求1的方法，其中所述方法包括在所述宿主细胞中表达： -至少一种编码第一重链的核酸构建体，其中恒定区的氨基酸序列经过修饰，使得铰链 区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域，诸如CH3区，不含有任何能够在IVIG存 在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间 键的氣基酸残基，和 -至少一种编码第二重链的核酸构建体，其中所述第二重链能够在IVIG存在下或在施 用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键。4. 一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或更多种不同抗体的混合物的方法， 包括在所述宿主细胞中表达 a) 至少一种编码共同轻链的核酸构建体，和 b) 两种或更多种编码重链的核酸构建体，所述两种或更多种核酸构建体包含 bl)两种或更多种编码两种或更多种不同第一 IgG4重链的核酸构建体，其中所述第一 IgG4重链的每个恒定区的氨基酸序列经过修饰，使得铰链区不含有任何能够在IVIG存在 下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键 的氨基酸残基， 或 b2)至少一种编码第一 IgG4重链的核酸构建体，其中恒定区的氨基酸序列经过修饰， 使得铰链区不含有任何能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形 成二硫键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基，和 至少一种编码第二重链的核酸构建体，其中所述第二重链能够在IVIG存在下或在施 用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键，前提是 所述第二重链不是野生型IgG4重链， 其中每种所述重链能够与所述轻链配对以形成功能性抗体。5. 依照前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核酸构建体 包含编码SEQ ID N0:5所示的CH3区的序列，但是其中所述CH3区经过修饰，从而发生了 一处或多处下述的氨基酸替代：第238位Arg (R)已被Gin (Q)替换；第239位Asp (D)已被 Glu(E)替换；第249位Thr(T)已被Ala(A)替换；第251位Leu(L)已被Ala(A)替换；第 251位Leu (L)已被Val (V)替换；第288位Phe (F)已被Ala (A)替换；第288位Phe (F)已 被Leu (L)替换；第290位Tyr (Y)已被Ala㈧替换；第292位Lys (K)已被Arg (R)替换；第 292位Lys(K)已被Ala(A)替换；第302位Gln(Q)已被Glu(E)替换；和第328位Pro(P) 已被Leu (L)替换。6. 依照权利要求5的方法，其中第292位Lys (K)已被Arg (R)替换。7. 依照前述权利要求5或6中任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核酸 构建体进一步包含编码SEQ ID NO :5所示的CH1和/或CH2区的序列。8. 依照前述权利要求5至7中任一项的方法，其中轻链的恒定区经过修饰，使得它不含 有任何能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的恒定区形成二硫键或其 它共价键的氨基酸。9. 依照权利要求8的方法，其中所述至少一种编码共同轻链的核酸构建体包含编码具 有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的kCL区的序列，但是其中所述序列经过修饰，使得第 106位末端半胱氨酸残基已被另一种氨基酸残基替换或已被删除。10. 依照权利要求8的方法，其中所述至少一种编码共同轻链的核酸构建体包含编码 具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的λα区的序列，但是其中所述序列经过修饰，使得 第104位半胱氨酸残基已被另一种氨基酸残基替换或已被删除。11. 依照前述权利要求5至7中任一项的方法，其中所述重链的恒定区经过修饰，使得 它含有能够与所述轻链形成二硫键或其它共价键的残基。12. 依照前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核酸构建 体包含编码SEQ ID NO :5所示的CH1区的序列，但是其中所述CH1区经过修饰，使得第14 位Ser(S)已被半胱氨酸残基替换。13. 依照前述权利要求1至6中任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核酸 构建体包含编码SEQ ID NO :6所示的CH3区的序列，但是其中所述CH3区经过修饰，从而发 生了一处或多处下述的氨基酸替代：第234位Arg(R)已被Gin(Q)替换；第245位Thr(T) 已被Ala㈧替换；第247位Leu (L)已被Ala㈧替换；第247位Leu (L)已被Val (V)替换； 第276位Met (M)已被Val (V)替换；第284位Phe (F)已被Ala (A)替换；第284位Phe (F) 已被Leu (L)替换；第286位Tyr (Y)已被Ala㈧替换；第288位Lys (K)已被Arg (R)替换； 第288位Lys (K)已被Ala (A)替换；第298位Gin (Q)已被Glu (E)替换；和第324位Pro (P) 已被Leu (L)替换。14. 依照权利要求13的方法，其中第288位Lys (K)已被Arg (R)替换。15. 依照前述权利要求13至14中任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核 酸构建体进一步包含编码SEQ ID NO :6所示的CH1和/或CH2区的序列。16. 依照前述权利要求1至6中任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核酸 构建体包含编码SEQ ID N0:7所示的CH3区的序列，但是其中所述CH3区经过修饰，从而发 生了一处或多处下述的氨基酸替代：第285位Arg(R)已被Gin (Q)替换；第296位Thr(T) 已被Ala㈧替换；第298位Leu (L)已被Ala㈧替换；第298位Leu (L)已被Val (V)替换； 第314位Ser (S)已被Asn (N)替换；第322位Asn (N)已被Lys (K)替换；第327位Met (M) 已被Val (V)替换；第335位Phe (F)已被Ala (A)替换；第335位Phe (F)已被Leu (L)替换； 第337位Tyr (Y)已被Ala㈧替换；第339位Lys (K)已被Arg (R)替换；第339位Lys (K) 已被Ala㈧替换；第349位Gin (Q)已被Glu(E)替换；第352位lie (I)已被Val (V)替换； 第365位Arg (R)已被His (H)替换；第366位Phe (F)已被Tyr (Y)替换；和第375位Pro (P) 已被Leu (L)替换。17. 依照权利要求16的方法，其中第339位Lys (K)已被Arg (R)替换。18. 依照前述权利要求16至17中任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核 酸构建体进一步包含编码SEQ ID NO :7所示的CH1和/或CH2区的序列。19. 依照前述权利要求1至6中任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核酸 构建体包含编码SEQ ID NO :2所示的CH3区的序列，但是其中所述CH3区经过修饰，从而发 生了一处或多处下述的氨基酸替代：第234位Thr(T)已被Ala (A)替换；第236位Leu (L) 已被Ala㈧替换；第236位Leu (L)已被Val (V)替换；第273位Phe (F)已被Ala㈧替换； 第273位Phe (F)已被Leu (L)替换；第275位Tyr (Y)已被Ala (A)替换。20. 依照前述权利要求1至6任一项的方法，其中所述至少一种编码第一重链的核酸构 建体包含编码SEQ ID NO :2所示的CH3区的序列。21. 依照权利要求20的...

【专利技术属性】
技术研发人员：P帕伦，JJ尼杰森，AF拉布里杰恩，J舒尔曼，T文克，J范德温克尔，S洛夫里克斯，I拉斯特斯，
申请(专利权)人：根马布股份公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK