用于生成抗体混合物的方法技术

技术编号:7183826 阅读:305 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或更多种不同抗体的混合物的方法。在一个实施方案中,生成了不同单价抗体的混合物不同。在另一个实施方案中,生成了单价和二价抗体的混合物。本发明专利技术还涉及通过本发明专利技术的方法可获得的抗体混合物及在本发明专利技术的方法中特别有用的轻链序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了、通过本专利技术的方法可获得的混合物及此类混合物的用途,特别是在治疗癌症中的用途。本专利技术还涉及在本专利技术的方法中特别有用的轻链。
技术介绍
当前,有多种人类疾病是通过治疗性单克隆抗体,例如人源化的或完全人源的单克隆抗体来治疗的。然而,一些疾病通过单克隆抗体不能充分有效地治疗,或者治疗效果随单克隆抗体应用的时间而降低,例如由于靶物下调或致病途径的转换。因此,一种备选方案可以是用多克隆抗体或抗体混合物来治疗。此类抗体混合物可包含两种或更多种针对同一靶物上不同表位的抗体,或者,针对不同靶物的抗体的混合物。US7262028记载了一种通过表达一种轻链和不同重链从单一宿主细胞克隆生成二价抗体或二价抗体混合物的方法。中披露的专利技术提供了一种用于生成抗体组合的方法,可以对该抗体组合筛选在多种应用中的有用性。治疗性抗体的期望特征可依照要治疗的具体状况而变化。对于一些适应证,只需要抗原结合,例如其中抗体的治疗效应是阻断抗原与一种或多种原本能够结合抗原的特定分子之间的相互作用。对于其它适应证,可能还需要别的由抗体介导的效应,诸如诱导补体活化、结合Fc受体等的能力。对于此类用途,抗体分子中抗原结合部分以外的部分诸如Fc 区可能是重要的。一些全长抗体在结合靶抗原时可展现激动效应(这可能被认为是不期望的,特别是对于癌症治疗而言)。在一些情况下,此效应可归于通过二价抗体的“交联”;“交联”促进二聚化,而二聚化可导致活化,尤其当靶物是受体时。在可溶性抗原的情况下,二价靶向性(bivalent targeting)可形成不期望的免疫复合物。因此,对于一些治疗性适应证,单价抗体可能是优选的。单价抗体的例子包括Fab片段、scFv抗体和纳米抗体。另一类包含一条重链和一条轻链的单价抗体(UniBody 分子)已记载于W02007/059782、W0/2008/145137、 W0/2008/145138、W0/2008/145139和W0/2008/145140。在这些分子中,重链的序列已经被修饰,使得不形成重链间键,从而不形成二价抗体。UniBody 分子的特征在于与Fab片段相比有利的药动学。需要改良的基于抗体的疗法,将使用多克隆抗体或抗体混合物的优点与单价抗原结合的优点结合起来。本专利技术提供了用于生成单价抗体的混合物或单价和二价抗体的混合物的方法。专利技术概述在第一个主要方面,本专利技术涉及一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或更多种不同抗体的混合物的方法,包括在所述宿主细胞中表达a)至少一种编码共同轻链的核酸构建体,和b)两种或更多种编码重链的核酸构建体,所述两种或更多种核酸构建体包含bl)编码两种或更多种不同第一重链的两种或更多种核酸构建体,其中所述各第8一重链的每个恒定区的氨基酸序列经过修饰,使得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH 区的其它区域,诸如CH3区,不含有任何能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基,或b2)至少一种编码第一重链的核酸构建体,其中恒定区的氨基酸序列经过修饰,使得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域,诸如CH3区,不含有任何能够在 IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基,和至少一种核酸编码第二重链的构建体,所述第二重链能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键,其中每种所述重链能够与所述轻链配对以形成功能性抗体。因此,所述第一重链的序列经过修饰而不形成稳定的重链间键,并且由此所得抗体是单价的(参见例如W02007/059782)。因而,在备选方案bl的情况下,在同一细胞中生成不同单价抗体的混合物。此类混合物可例如用于治疗疾病,特别是单克隆单价抗体和/或多克隆二价抗体的有效性不是最好的疾病,如上文解释的。在备选方案1^2的情况下,在同一细胞中生成单价和二价抗体的混合物。此类混合物可例如用于治疗疾病,诸如癌症。在一个特别有趣的实施方案中,所述单价抗体通过对靶蛋白的拮抗性结合或阻断来抑制细胞增殖,且所述二价抗体结合另一种靶抗原,例如在同一靶细胞上的,并募集效应器功能进行靶细胞杀伤。在另一个主要方面,本专利技术涉及一种包含通过本专利技术的方法获得的或可获得的抗体混合物的组合物,诸如药物组合物。在另一个方面,本专利技术提供了一种适合依照上述方法用于生成抗体混合物的重组宿主细胞。本专利技术还提供了依照上述专利技术的组合物用于治疗疾病的用途。本专利技术还公开了一种特别适合于在本专利技术中使用的共同轻链,因为它能替换各种不同抗原特异性抗体的轻链而不损失特异性。此类轻链可更一般性地用于这样的含有抗体产品的应用,其中将一种轻链与多种重链组合,诸如在重组多克隆或双特异性抗体中组合。因此,在另一个方面,本专利技术涉及一种包含重链和轻链的重组抗体,其中所述轻链包含SEQ ID NO 8所示的序列。附图和序列表简述附图说明图1。在ELISA中测量经转染的HEK493F细胞的细胞培养物上清液中存在的单价抗体对可溶性的带His标签的CD38的结合。“单价Uni-005”指示经单价Uni-005(抗 CD38)构建体转染的HEK493F细胞的上清液;“单价组合”指示表达Uni_7D8 (抗CD20)和 Uni-005的重链与抗⑶38抗体005的轻链的组合的细胞的上清液。图2。在ELISA中测量经转染的HEK493F细胞的细胞培养物上清液中存在的单价抗体对一种抗HuMab-7D8的抗独特型抗体(其也结合Uni_7D8)的结合。“单价Uni_7D8” 指示经Uni-7D8构建体转染的HEK493F细胞的上清液;“单价组合”指示表达Uni_7D8和 Uni-⑶38的重链与抗⑶38抗体005的轻链的组合的细胞的上清液。9图3 对人κ轻链种系文库筛选对各种重链的结合以鉴定共同轻链。在使用重组可溶性抗原作为包被物的ELISA中筛选经瞬时转染的HEK493F细胞的上清液的结合,其中所述细胞表达带有对EGFr (A)、c-Met(B)或Her2 (C)特异性的可变域的铰链修饰(F273T、 Y275E)的重链,以及一条来自该文库的种系κ轻链。每个点代表一种独特的重链和轻链组合,并显示了结合(0D405)和表达(1 20稀释后的μ g/mL)。形成功能性结合抗体的重链和轻链组合标有1、2和3。(1'、2'和3'是该测定法中1、2和3的重复)。每项实验中用伴随各重链的原来的κ轻链作为阳性对照(矩形)图4 通过共表达和对重组靶物的结合ELISA对共同轻链的确认。在使用重组可溶性抗原(分别为EGFR(A)、c-Met⑶或Her2 (C))作为包被物的ELISA中,对经瞬时转染的HEK493F细胞的上清液筛选结合,其中所述细胞共表达三种分别带有对EGFR、c-Met和 Her2特异性的可变域的铰链修饰(F273T、Y275E)的重链、以及一条在初筛选中鉴定的共同 κ轻链种系序列(图3中的1、2或3)。每项实验中包括伴随各重链的原来的κ轻链作为阳性对照。图5 用交联ELISA确定抗体单价性。用交联ELISA对经瞬时转染的HEK493F细胞的上清液测试单价性,其中所述细胞共表达三种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或更多种不同抗体的混合物的方法,包括在所述宿主细胞中表达:a)至少一种编码共同轻链的核酸构建体,和b)两种或更多种编码重链的核酸构建体,所述两种或更多种核酸构建体包含b1)两种或更多种编码两种或更成功能性抗体。区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基,和至少一种编码第二重链的核酸构建体,其中所述第二重链能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH区形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键,其中每种所述重链能够与所述轻链配对以形定非共价重链间键的氨基酸残基,或b2)至少一种编码第一重链的核酸构建体,其中恒定区的氨基酸序列经过修饰,使得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域,诸如CH3区,不含有任何能够在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时与相同的CH多种不同的第一重链的核酸构建体,其中所述第一重链的每个恒定区的氨基酸序列经过修饰,使得铰链区及如免疫球蛋白亚型所要求的CH区的其它区域,诸如CH3区,不含有任何在IVIG存在下或在施用于哺乳动物或人类时能够与相同的CH区形成二硫键或共价或稳

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:P帕伦JJ尼杰森AF拉布里杰恩J舒尔曼T文克J范德温克尔S洛夫里克斯I拉斯特斯
申请(专利权)人:根马布股份公司
类型:发明
国别省市:DK

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