选出蛋白酶抗性多肽的方法技术

本发明专利技术涉及从肽和多肽的文库或集合（例如展示系统）中挑选、分离和／或回收抗蛋白酶（比如血清中可见的蛋白酶）降解的肽或多肽的方法。总体上，所述方法包括提供肽或多肽文库或集合；在适合蛋白酶活性的条件下将文库或集合与蛋白酶一起温育；并挑选、分离和／或回收抗蛋白酶降解并具有所需生物活性的肽或多肽。选中的肽和多肽可以作为治疗剂用于例如治疗人的疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
多肽和肽已成为包括工业应用和作为医学、治疗以及诊断剂的众多用途中日益重要的物质。但是，许多治疗用肽和蛋白质在体内特别容易受到天然蛋白酶的降解。而且，一些生理状态下，比如炎症状态(例如C0PD)和癌症，组织、器官或动物(例如在肺中、肿瘤内或者肿瘤附近)中存在的蛋白酶的量可能会增加。蛋白酶的这种增加会导致内源蛋白以及为了治疗疾病而给予的治疗用肽、多肽和蛋白的降解和灭活。因此，一些有潜力用于体内的药剂由于被蛋白酶迅速地降解和灭活，而只有有限的药效。蛋白酶抗性多肽具有多种优势。例如，蛋白酶抗性多肽在体内比蛋白酶敏感性制剂保持更长时间的活性，因此能够在一段时间内维持功能，足以产生生物学效应。需要选择能够抗蛋白酶降解并具备所需生物活性的多肽的改进方法。胰高血糖素样肽(Glucagon-like peptide, GLP)_1是一种肠促胰岛素激素，它具有强大的葡萄糖依赖性促胰岛素和抑制高血糖素作用、对胰岛β细胞的滋养效果，以及对胃肠分泌和蠕动的抑制效应，这些结合起来使得血浆葡萄糖降低并减少血糖波动。GLP-I是 GLP-I受体的激动剂。此外，通过其增加饱腹感的能力，GLP-I减少食物摄入，从而限制体重增加，甚至可能造成体重下降。综合起来，这些作用使得GLP-I很独特，被认为很有希望作为抗糖尿病药物，尤其是因为它的抗高血糖效应对葡萄糖的依赖性应当能使严重低血糖的任何风险最小化。但是，它的药物代谢动力学/药效动力学特性使得它不能用于治疗。因此，GLP-I在连续给药时最有效，而单次皮下注射只有短期效果。GLP-I在体内对酶促降解高度易感，其中最相关的是被二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割，因为发生的非常迅速并且产生非促胰岛素代谢产物。因此基于对影响GLP-I的代谢稳定性以及药物代谢动力学/药效动力学特性的因素的理解，增强其治疗潜力的策略一直以来是大量研究的重点。已有大量工作试图抑制蛋白酶或者对GLP-I进行修饰，从而使得在维持生物活性的同时减慢它的降解。W005/027978公开的GLP-I衍生物具有延长的作用(通过引用并入本文作为可用于本专利技术的GLP-I衍生物和类似物的例子)。WO 02/46227公开了异源融合蛋白，其包含与GLP-I或类似物(关于这些类似物的公开通过引用并入本文作为可以用于本专利技术的GLP-I类似物的例子)融合的多肽(例如白蛋白)。W005/003296.W003/06007U W003/059934公开了氨基融合蛋白，其中GLP-I融合了白蛋白以便提高激素的半衰期。然而，尽管有这些努力，还没有生产出有长期活性的GLP-1。专利技术概述本专利技术涉及选择蛋白酶抗性肽或多肽的方法，以及选择与靶配体高亲和力结合的肽或多肽的方法。专利技术还涉及制备蛋白酶抗性肽或多肽集合的方法。一个方面，专利技术是用于选择蛋白酶抗性肽或多肽的方法。所述方法包括提供肽或多肽集合，将集合与蛋白酶在适合蛋白酶活性的条件下温育，以及回收具有所需生物活性的肽或多肽，从而选择到蛋白酶抗性肽或多肽。一个实施方案中，在展示系统中表达所述肽或多肽集合，所述蛋白酶是该展示系统或表达宿主中表达的蛋白酶。例如，在一个实施方案中，肽或多肽集合表达在细菌细胞内，蛋白酶是该细菌的内源蛋白酶。适合集合表达的条件使表达和内源蛋白酶(比如细菌蛋白酶)的活性最大化。蛋白酶表达和活性的最大化可以通过例如提高细菌中集合的蛋白表达时间和/或温度。例如，温育时间可以从1小时到过夜(例如从12到M小时)或者更长(例如从M到48小时，或者更长)。在一个实施方案中，温度可以是30到37摄氏度或者更高。此外，可以通过使用不同细菌菌株和/或改变培养基成分来增加蛋白酶表达。还可以使用不同细菌培养物密度。另一个实施方案中，可以通过例如基因修饰改变展示系统从而增强蛋白酶表达。在一个实施方案中，集合作为噬菌体展示系统来提供，其中噬菌体集合在大肠杆菌细菌细胞，比如大肠杆菌TBl细胞、TCl细胞或来自大肠杆菌菌株HB2151的细胞中表达和/或扩增。相应地，在该实施方案中，细菌蛋白酶是大肠杆菌细胞中内源表达的蛋白酶。 在一个实施方案中，细菌蛋白酶可以是表达在细菌细胞周质的蛋白酶。在一个实施方案中， 蛋白酶表达可以是在噬菌体产生、分泌期间或者在细菌上清中。因此，专利技术的一个实施方案中提供了这样的方法，所述方法步骤包括选择噬菌体文库、在细菌蛋白酶活性适宜的条件下在细菌中表达该文库、将表达的文库与目标配体温育，从而挑选出蛋白酶抗性的目标结合肽。任选地，所述与目标配体进行的温育包括另一种蛋白酶的存在。另一个实施方案中，展示系统是酵母菌展示系统，比如毕赤氏酵母；蛋白酶是酵母细胞内表达的内源蛋白酶。在一个实施方案中，依照专利技术的方法还包括将集合与另一种蛋白酶在适合所述另一种蛋白酶的活性的条件下组合，并回收具有所需生物活性的肽或多肽，从而挑选到蛋白酶抗性肽或多肽。在一个实施方案中，蛋白酶与集合在溶液中组合(即，蛋白酶被固定在支持物上)。可以在血清、痰、粘液(例如胃粘液、鼻粘液、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗液、 肺勻浆、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或眼泪中的一或多种中找到合适的另一种蛋白酶。另一方面中，提供了选择蛋白酶抗性肽或多肽的方法。所述方法包括提供肽或多肽集合、将集合与第一蛋白酶在适合蛋白酶活性的条件下温育，方法还包括将集合与第二蛋白酶在适合蛋白酶活性的条件下组合并回收具有所需生物活性的肽或多肽，从而挑选到蛋白酶抗性肽或多肽。这一方面的一个实施方案中，所述第一蛋白酶是集合展示系统的内源蛋白酶，第二蛋白酶选自可以在血清、痰、粘液(例如胃粘液、鼻粘液、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗液、肺勻浆、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或眼泪中找到的蛋白酶。但是应当明白，可以按照任何顺序进行所述“第一 ”和“第二”蛋白酶步骤。此外，可以理解，任何这种步骤的多个重复都涵盖在本专利技术方法的范围内。在专利技术任何方面的一个实施方案中，所述适合另一种或第二蛋白酶活性的条件是 ⑴大约10μ g/ml到大约;3mg/ml蛋白酶，(ii)大约20°C到大约40°C，以及(iii)至少大约30分钟。在一个实施方案中，这些严紧条件使得能够挑选到具有高亲和力和/或Tm增加的肽或多肽。这种情况中，肽和多肽可能以单体形式展示出高亲和力。在一个实施方案中，依照专利技术任何方面的方法中，对于适合蛋白酶活性的条件使用了大约10到大约ΙΟΟμ g/ml蛋白酶。对于所述适合蛋白酶活性的条件可以使用大约30 到大约37°C的温度(例如大约37°C或者大约室温)。在一个实施方案中，可以将集合和蛋白酶组合在一起至少大约1小时(例如，大约1小时、大约2小时、过夜，例如18到M小时)。本专利技术的方法中，集合和蛋白酶在一个实施方案中温育了至少约30分钟的时期。在一个实施方案中，使用的蛋白酶在大约100yg/ml，组合在一起的集合和蛋白酶在大约37°C温育了至少约1小时。在专利技术任何方面的一个实施方案中，蛋白酶(例如胰蛋白酶)与多肽或可变区的比率(基于摩尔/摩尔)是8，000到80，000蛋白酶可变区。在一个实施方案中，蛋白酶 (例如胰蛋白酶)与多肽或可变区的比率(基于重量/重量，例如微克/微克)是16，000 到160，000蛋白酶可变区。在一个实施方案中，使用的蛋白酶浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．从肽或多肽集合中挑选蛋白酶抗性肽或多肽的方法，所述方法包括提供肽或多肽集合；将集合与蛋白酶在适合蛋白酶活性的条件下温育；和回收具有所需生物活性的肽或多肽，从而挑选到蛋白酶抗性肽或多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡罗琳埃尼弗，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：发明
国别省市：GB