从浆细胞产生抗体的方法技术

本发明专利技术涉及产生抗体包括单克隆抗体的方法，包括培养有限数目的浆细胞。本发明专利技术还涉及鉴定抗体的方法，其是在由培养的浆细胞产生的抗体上进行测定以确定它们的功能、结合特异性、表位特异性和／或它们中和毒素或者病原体的能力。本发明专利技术还涉及由本发明专利技术的方法产生的抗体或者和抗体片段以及使用所述抗体或者抗体片段的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求以下各项申请的优先权申请日为2008年10月22日的英国专利申请No. 0819376. 5、申请日为2009年5月27日的美国临时专利申请系列号No. 61/181，582、 申请日均为2009年7月27日的PCT专利申请No. PCT/US2009/051851和美国专利申请 No.12/509，731。
技术介绍
浆细胞是终末分化的非增殖性细胞，它们以非常高速率分泌抗体(每秒几千个分子，相应于每天每个细胞大约30-50pg)。从浆细胞分离抗体例如单克隆抗体依赖于免疫球蛋白基因的克隆及表达。这可以使用分离自浆细胞的混杂的VH和VL基因的噬菌体展示文库进行，或者通过用单细胞 PCR从单浆细胞分离成对VH和VL基因而进行。但是，为了筛选由浆细胞产生的抗体，免疫球蛋白基因需要以重组形式克隆及表达以确定编码抗体的特异性和功能性质。这个方法是困难的、昂贵的、耗时的、不适于高通量且不能高效获得由浆细胞所有组成成分(total repertoire)的一小部分产生的稀有抗体。因此，需要鉴定更高效的适于高通量从浆细胞分离和筛选抗体例如单克隆抗体的方法。专利技术概述本专利技术部分基于发现了从浆细胞产生抗体的有效及高通量方法，其使得无需依赖于免疫球蛋白基因的克隆及表达便能表征抗体。用本专利技术产生的抗体可以通过多重筛选进行表征，包括结合、功能和/或中和测定。本专利技术提供了鉴定由浆细胞产生的稀有抗体的方法。因此，在本专利技术一个方面，本专利技术提供了，包括培养有限数目的浆细胞。在一个实施方案中，本专利技术提供了从浆细胞产生单克隆抗体的方法，包括以单细胞培养物培养浆细胞。本专利技术的方法可进一步包括表征抗体或者抗体片段。抗体或者抗体片段的表征包括但非限于进行功能测定以确定抗体或者抗体片段的功能，进行结合测定以确定抗体或者抗体片段的结合特异性或者由所述抗体或者抗体片段识别的表位，和/ 或进行中和测定以确定抗体或者抗体片段中和毒素或者病原体的能力。在另一个实施方案中，本专利技术提供了产生抗体或者抗体片段的方法。所述方法包括培养有限数目的浆细胞；鉴定产生具有所需特征的抗体的培养物；分离编码所产生的抗体的核酸；以及在宿主细胞中表达所述核酸。在本专利技术另一方面，本专利技术提供了由本专利技术的方法产生的分离的抗体或者抗体片段。本专利技术还提供了用本专利技术的分离的抗体或者抗体片段诊断和/或治疗各种病症或疾病的方法。附图简述附图说明图1示出由⑶138+浆细胞累积产生的IgG，所述浆细胞分离自外周血并且在间充质基质细胞单层上培养50天。图2示出由含有分离自㈧外周血和⑶骨髓的单个浆细胞的培养物中的CD138+ 浆细胞累积产生的IgG。图3示出测试分离自外周血并在间充质基质细胞单层上培养的⑶138-high浆细胞的10天培养物上清液中IgG、IgA、IgM和IgE的存在的结果。图4示出产生IgG、IgA或IgM抗体的抗体分泌细胞(ASC)当在hMSC_TERT细胞上培养时的平板效率(plating efficiency)，并且表示为存活时间长到足以在上清液中产生可检测量抗体的浆细胞的百分数。图5示出在破伤风类毒素(TT)加强免疫后7天从收集的外周血分离的浆细胞中鉴定分泌破伤风类毒素特异性IgG的浆细胞。图6示出由培养的浆细胞回收的VH和VL基因的克隆和表达产生的重组抗体与破伤风类毒素的结合，所述培养的浆细胞分离自用破伤风类毒素免疫接种后10年的供体的血液。专利技术详细描述本专利技术基于从浆细胞产生抗体的有效及高通量方法的发现，其使得无需依赖于免疫球蛋白基因的克隆及表达便能表征抗体。在一个方面，本专利技术提供了，包括培养有限数目的浆细胞。用本专利技术产生的抗体可以通过使用多种筛选而方便地表征，所述筛选包括结合、功能和/或中和测定，甚至可以原位进行，即在培养浆细胞的孔中进行。如本文所用，术语“浆细胞”包括在外周血、骨髓、组织或体液中发现的或者体外从 B细胞产生的所有原代抗体分泌细胞(ASC)。新近产生的浆细胞被称为“成浆细胞”。天然产生的成浆细胞通常在血液特别是外周血中发现。成浆细胞也可以在体外通过用各种刺激物包括多克隆激活物如TLR激动剂刺激B细胞而产生。在此，术语“浆细胞”应被认为包括 “浆细胞”、“成浆细胞”及ASC。理论上，可以在培养基中培养任何数目的浆细胞以产生和鉴定具有所需特征的抗体。实践中，可以被培养的浆细胞数目由于现有的用于克隆和表达多克隆细胞培养物中存在的多个VH和VL基因序列及其组合的技术而受到限制。在一个实施方案中，“有限数目的浆细胞”是指浆细胞的数目是大约100或更少，例如90或更少、80或更少、70或更少、60或更少、50或更少、45或更少、40或更少、35或更少、30或更少、25或更少、20或更少、17或更少、15或更少、12或更少、10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、2或更少、或者1或更少。在一个实施方案中，本专利技术提供了，包括在培养物中以低浆细胞浓度培养浆细胞。培养物中的低浆细胞浓度通常包括每个培养物大约1至大约10 个、或者大约1至大约15个、或者大约1至大约20个、或者大约1至大约25个、或者大约1 至大约30个、或者大约1至大约40个、或者大约1至大约50个、或者大约1至大约60个、 或者大约1至大约70个、或者大约1至大约80个、或者大约1至大约90个、或者大约1至大约100个细胞。在另一个实施方案中，本专利技术提供了，包括培养浆细胞， 其中所述浆细胞在每个培养物中已被稀释至低细胞浓度。在另一个实施方案中，本专利技术提供了，包括培养降低数目的浆细胞。分离自例如生物学来源的浆细胞数目可以如下所述降低。如本文所用，“降低数目的浆细胞”与上述“有限数目的浆细胞”可互换使用。在培养物中获得所需细胞数目的技术是本领域公知的。这种技术包括但非限于有限稀释或者细胞分选和沉积。例如，包含有限或降低数目浆细胞的培养物可以通过使用细胞分选仪经单细胞沉积或者用足够培养基稀释浆细胞悬液而实现，从而微滴定培养平板每个孔存在1个、2个、3个或者更多个、例如5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50 个、60个、70个、80个、90个或100个细胞。在一个实施方案中，培养单个浆细胞。鉴于由单个浆细胞产生的抗体的单克隆性质，以单细胞培养物培养浆细胞会产生单克隆抗体群。因此，在一个实施方案中，本专利技术提供了从浆细胞产生单克隆抗体的方法，包括以单细胞培养物培养浆细胞。如本文所用，“单细胞培养物”与“培养单个浆细胞”可互换使用，并且涉及一种培养物，其平均包含单个浆细胞。因此，在多孔板例如96孔板或者1536孔板中，大多数孔含有单个浆细胞，一些孔不含浆细胞，其它一些孔含有一个以上浆细胞。在一些实施方案中， 浆细胞可以在其中每孔中有平均少于1个细胞、例如0. 8个细胞/孔、0. 6个细胞/孔、0. 5 个细胞/孔、0. 3个细胞/孔或者0. 1个细胞/孔的培养物中培养浆细胞。获得培养物中单细胞的技术与上述类似，除了微滴定培养平板每孔存在平均1个或者少于1个细胞。本专利技术进一步提供了产生抗体或抗体片段的方法。所述方法包括根据本专利技术任何方法培养有限数目的浆细胞，鉴定产生具有所需特征的抗体的培养物，分离编码所产生的抗体的核酸，以及在宿主细胞中表达所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．从浆细胞产生抗体的方法，包括：培养有限数目的浆细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·兰扎韦基亚，
申请(专利权)人：生物医学研究所，
类型：发明
国别省市：CH