本发明专利技术属于生物工程领域，公开了一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白，它具有两个功能结构域，由Ｎ端的乙肝表面抗原前Ｓ抗原ｐｒｅＳ２和主蛋白Ｓ，及Ｃ端的鼠ＩｇＧ１ Ｆｃ段组成。本发明专利技术还公开了含有编码所述融合蛋白基因的载体。本发明专利技术还公开了一种抗体化的乙肝疫苗。本发明专利技术所构建的抗体化乙肝疫苗，可以诱导很强的体液免疫应答和细胞免疫应答，具有比传统疫苗更好的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种结构融合分子，特别是一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白及含有此融合蛋白编码基因的载体。
技术介绍
乙肝是危害人类健康的一大疾病，在我国尤其严重。由于传统的血源性疫苗安全性差，产量较低，因此已被基因工程疫苗所取代。由于大部分乙肝患者为幼儿时期感染病毒，处于对HBSAg的免疫耐受状态，现存的基因工程疫苗虽然可以在大部分人中诱导出抗体，但对于已经感染乙肝病毒的患者作用不大。因为对于病毒和胞内菌而言，中和性抗体可以阻断它们进入胞内，但不能清除已经进入细胞内的病毒或者细菌。对于此类患者，需要能诱导出较强细胞免疫应答的治疗性疫苗。乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白，由3种蛋白组成主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)，目前市场上的乙肝疫苗主要为S蛋白疫苗，而M和L蛋白N端的preS1和preS2区含有许多重要的T、B抗原决定簇，它们在增强S蛋白的反应、克服对S蛋白的无反应中起着重要作用。因此，研究一种包含有preS1或preS2区的疫苗，并且达到提高细胞免疫应答、低毒、易于制备的效果是目前现有技术中急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白，它具有第一部分和第二部分，所述的第一部分为乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，所述的第二部分为鼠IgG1 Fc段。进一步的，所述的融合蛋白的第一部分具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。进一步的，所述的融合蛋白的第一部分具SEQ ID NO3有所示的基因序列，所述的融合蛋白的所述的第二部分具有SEQ ID NO4所示的基因序列。进一步的，所述的融合蛋白的所述的第一部分和第二部分通过设计限制性酶切位点来进行连接。本专利技术的目的还在于提供所述的融合蛋白在制备乙肝疫苗的药物中的应用。本专利技术的目的还在于提供一种载体，含有上述所述的融合蛋白的编码基因。进一步的，所述的载体含有SEQ ID NO9所示的基因序列。进一步的，所述的载体含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。本专利技术的目的还在于提供所述的载体在制备乙肝疫苗的药物中的应用。本专利技术的目的还在于提供制备所述的融合蛋白的方法，包含以下步骤1)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)获得鼠IgG1 Fc段编码基因；3)将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段编码基因克隆入质粒，获得含有目的基因的载体，通过原核或者真核细胞表达获得表达蛋白。本专利技术的目的还在于提供制备所述的载体的方法，包含以下步骤1)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)获得鼠IgG1 Fc段编码基因；3)将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段编码基因克隆入质粒，获得含有目的基因的载体。更具体的，制备上述所述的载体的方法，包含以下步骤1)设计扩增乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因的合适酶切位点的引物，2)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，3)设计扩增鼠IgG1 Fc段编码基因的合适酶切位点的引物，4)获得鼠IgG1 Fc段编码基因，5)将获得的preS2-S克隆入含有相应酶切位点的PcDNA3质粒，获得PCS2S载体，再将IgG1 Fc克隆入含有相应酶切位点的质粒PCS2S，获得PCMFS载体。本专利技术的目的还在于提供一种抗体化的乙肝疫苗，含有上述所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。本专利技术的目的还在于提供一种抗体化的乙肝疫苗，含有有效量的上述所述的载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。本专利技术人通过长期而广泛的研究发现，将乙肝表面抗原与IgG的Fc段融合，可通过抗原摄取方式和递呈方式的改变，从而可从根本上打破乙肝免疫耐受，显著提高治疗性疫苗的效果。乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白，由3种蛋白组成主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)，目前的乙肝疫苗主要为S蛋白疫苗，而M和L蛋白N端的preS1和preS2区含有许多重要的T、B抗原决定簇，它们在增强S蛋白的反应、克服对S蛋白的无反应中起着重要作用。另外preS2通过人多聚白蛋白介导结合于肝细胞的表面，所以含pres2的疫苗可与HBV竞争从而阻断HBV的感染途径。故我们设计的乙肝疫苗包含了preS2和S基因。IgG Fc能与Fc受体结合，preS2和S基因与鼠IgG1 Fc段的融合一方面能促进融合蛋白被DC细胞的摄取，另一方面融合蛋白在胞内与Fc受体结合，促进了PreS2-S蛋白以内源性抗原的方式进行递呈，从而有利于活化CD8+T细胞，促进了特异性的细胞免疫应答。鉴于APC细胞表达的Fc受体以FcγR为主，而IgG1与FcγR亲和力较强，因此我们选择了来自IgG1亚型的Fc段。并且，Fc段与Fc受体结合的位点位于铰链区和CH2段，且抗体的铰链区富含脯氨酸而易于伸展弯曲，能够使融合蛋白的两个部分之间的位障减到最小程度，所以我们选择的Fc段包括铰链区Hinge和CH2+CH3。因此，在本专利技术中，所述的融合蛋白将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S作为融合蛋白的N端，可作为疫苗抗原部分；鼠IgG1 Fc段作为融合蛋白的C端，可使疫苗具有抗体化特征。本专利技术将获得的乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及获得的鼠IgG1 Fc段编码基因克隆入质粒，获得含有目的基因的载体成为基因疫苗，通过原核或者真核细胞表达获得表达蛋白成为蛋白疫苗，所述的基因疫苗的5’端为抗原表位部分，由表面抗原前S蛋白preS2和主蛋白S组成的preS2-S基因；它的3’端为抗体的Fc段基因。所述的蛋白疫苗的N端为抗原表位部分，由表面抗原前S蛋白preS2和主蛋白S组成，它的C端为抗体的Fc段。本专利技术的融合蛋白可以通过多种方式制备获得，包括但不限于a)化学合成；b)将目的基因克隆入适当的载体，表达出目的融合蛋白。所述融合蛋白的第一部分和第二部分之间可以是带有连接序列(linker)的或直接相连接的；优选的，第一部分和第二部分之间可直接相连，直接利用抗体分子的绞链区富含脯氨酸而易于伸展弯曲的特性，将两部分连接起来，在保证了各自功能基团的独立性的同时也有助于形成稳定的空间结构。在本专利技术中，用于克隆入目的基因的载体包括任何哺乳动物细胞转化用载体，或病毒载体，尤其是各种市售的载体或病毒载体。包括但不限于PcDNA、pEGFP、pSEc、pMG18、pGL3等。在本专利技术中，可用于转化所述融合基因的载体的细胞为原核或者真核生物细胞，比如、CHO细胞等。将特定DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转化方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达所需的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在本专利技术中，所述的药物组合物中有效成分的存在形式包括但不限于以下几类a)乙肝表面抗原前S抗原和主蛋白S以及鼠IgG1 Fc段的融合蛋白；b)含有乙肝表面抗原前S抗原和主蛋白S以及鼠IgG1 Fc段基因的载体；c)含有b)所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白，其特征在于，它具有第一部分和第二部分，所述的第一部分为乙肝表面抗原前Ｓ抗原ｐｒｅＳ２和主蛋白Ｓ，所述的第二部分为鼠ＩｇＧ１Ｆｃ段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：熊思东，王缨，蒋正刚，储以微，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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