产生高度有效抗体的SARS疫苗和方法技术

本发明专利技术提供一种疫苗，其包括有效量的含有ＳＡＲＳ相关的冠状病毒突起蛋白中受体结合结构域序列或其功能片段的分离的多肽或重组蛋白，或者提供一种核酸分子，其包括编码严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中受体结合结构域序列或其功能片段的序列。本发明专利技术提供一种用于增加抗原的免疫原性的组合物，其包括有效量的抗原和ＩｇＧ　　Ｆｃ结构域，其功能片段，或者含有ＩｇＧ　　Ｆｃ结构域或其功能片段的物质。所述抗原和ＩｇＧ　　Ｆｃ可以是连接的或不连接的。最后，本发明专利技术还提供将任何上述组合物用于免疫的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生高度有效抗体的SARS疫苗和方法本申请要求2005年5月31日提交的尚未获得美国序列号的申请和 2004年6月2日提交的美国序列号60/576,118的申请的优先权，这两个 申请的全文内容并入本申请中。本申请引用了许多出版物。为了更充分地描述本专利技术所属的
的状态，因而通过引用，将这些出版物的完整内容并入本申请中。
技术介绍
严重急性呼吸道综合征(SARS), —种新出现的感染疾病，由SARS-相关的冠状病毒(SARS-CoV)引起，其可能源于一些野生动物。 2002/2003年的SARS全球暴发导致数千病例和数百例死亡，严重地威胁 全世界的公共健康。在2003年年末和2004年年初，在中国报道了几例新 的SARS-CoV感染，其毒株不同于那些造成2002/2003年大流行的 SARS-CoV毒株。在台湾、新加坡和中国报道了由于SARS-CoV分离 株的意外释放而引起的一些单独的发作(http:〃www.who.int/csr/sars/en)。这 些结果表明，SARS流行病可能在将来的任何时候复发，其通过SARS-CoV 由动物到人的传播或通过从实验室样品溢出的病毒导致发生。因此，迫切 需要开发有效的和安全的疫苗用于保护受威胁的人群。目前，在中国，应用灭活SARS-CoV的一种候选疫苗正处于I期临床 实验。尽管已经表明所述灭活的SARS-CoV有效地保护动物免受 SARS-CoV的攻击，但是它在人中的功效尚不清楚。由于病毒体中的一些 抗原可以引起不中和而是增强病毒感染的抗体，因此，关于它的安全性存 在重要的关注。 一些病毒蛋白可以诱导有害的免疫和炎性反应，这是 SARS发病机理的潜在的起因和应用免疫抑制剂(例如，类固醇)用于 SARS治疗的基本原理(对这种治疗方案还有很大的争议)。最近， 据报道，雪貂的SARS-CoV感染引起轻微的肝脏炎症，并且如果雪貂在病毒攻击之前第一次用基于牛痘病毒的SARS疫苗免疫的话，所述肝脏损 伤变得严重得多。冠状病毒S蛋白负责病毒结合、融合和进入，并且是中和性抗体的主 要诱导剂。此外，它们在病毒发病机理和毒性中起着重要的作用 。 SARS-CoVS蛋白对于病毒功能和抗原性也是重要的。它是 由两个结构域，S1和S2组成的I型跨膜糖蛋白(图l)。 Sl负责病毒 与靶细胞上的受体结合。已经证明血管紧张肽转变酶2 (ACE2)是 SARS-CoV的功能受体。位于Sl中间区域的片段是受体结合结构 域(RBD) 。 S2结构域，其含有推定的融合肽和2个七残基重复序 列(HR1和HR2)区域(附图说明图1)，负责病毒和靶细胞膜之间的融合。如同衍 生于HIV-1 gp41 HR2区域的抗-HIV肽，衍生于SARS-CoV S蛋白 HR2区域的肽被鉴定为SARS-CoV感染的抑制因子。 HR1和HR2区 域可以缔合形成六螺旋束结构，类似于HIV中gp41 和其它冠 状病毒，诸如小鼠肝炎冠状病毒(MHV)中的S蛋白的融合活性核 心结构。这些结果表明， 一旦病毒S蛋白上的RBD结合于靶细胞上的 ACE2， S2就通过HR1和HR2区域之间的相互作用而改变构象，从而形 成融合核心结构并且使得病毒和靶细胞膜紧密接近，导致病毒融合和进入 。这表明含有S蛋白上的功能结构域的片段可以用作抗原，用来诱导 阻碍病毒结合或融合的抗体。一些编码SARS-CoV S蛋白的活的减毒的和遗传工程疫苗已经处于 临床使用前期的研究中。最近，Nabd和同事报道了编码S蛋白的DNA 疫苗候选物诱导T细胞和中和性抗体的反应(中和性抗体滴度在从l: 50 到1: 150的范围)，并且保护小鼠免受SARS-CoV攻击，如由呼吸道中 减少的SARS-CoV滴度所表明的那样。他们证明所述保护由中和性抗体 而不是T细胞依赖型机制而介导。目前，Moss同合作者证明，用包 含编码全长SARS-CoV S蛋白的基因的高度减毒修饰的疫苗病毒载体病 毒Ankara (MVA) (MVA/S)从鼻内或肌内接种小鼠，可产生具有SARS-CoV 中和活性的S特异性抗体(平均中和滴度是l: 284)，并且在从免疫小鼠 转移血清后保护小鼠免受SARS-CoV感染。这些数据表明，S蛋白可以诱 导保护性的中和性抗体，尽管所述中和性抗体滴度相对较低。含有连接到人IgG-Fc片段(用于辅助RBD纯化)上的RBD的重组 融合蛋白作为抗原(称为RBD-Fc，见图1)用于免疫小鼠和兔，可以在 免疫动物中诱导高度有效的中和性抗体反应(平均中和滴度1: 〉10,000)， 并且所述抗体可以结合RBD并阻碍RBD同ACE2的结合。这表明，RBD 可以作为预防SARS的亚单位疫苗进行应用。本专利技术公开一种重组融合蛋白或分离的多肽，其含有连接到人IgG-Fc 片段(用于辅助RBD纯化)的RBD，作为可以在免疫动物中诱导高度有 效中和性抗体反应(平均中和滴度对于兔是1: 15,360和对于小鼠是1: 12,553)的抗原(称为RBD-Fc，见图1)，这表明RBD可以作为预防SARS 的亚单位疫苗进行应用。专利技术概述严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(CoV)的突起蛋白(spike protein， Sproteiii)， 一种I型跨膜包膜糖蛋白，由分别负责病毒结合和融 合的Sl和S2结构域组成。Sl含有受体结合结构域(RBD)，其可以特异 性结合血管紧张肽转变酶(ACE2)—靶细胞上的受体。本专利技术提供包括有效量的分离的多肽或重组蛋白的疫苗，所述分离的 多肽或重组蛋白含有严重急性呼吸综合征(SARS)相关的冠状病毒突起 蛋白中的RBD序列，或其功能片段。本专利技术还提供一种包括有效量的核酸分子的疫苗，所述核酸分子包括 一个片段的序列，其编码严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒突起蛋白中 的RBD序列，或其功能片段。本专利技术还提供一种重组融合蛋白，其含有严重急性呼吸综合征相关的 冠状病毒突起蛋白中的RBD序列，或其功能片段，和人IgGFc片段(称 为RBD-Fc)的序列，或其功能片段。RBD-Fc可以在免疫动物，包括兔和小鼠中诱导高度有效的抗体反应。 所述抗体识别严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中Sl结构 域上的RBD序列，严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中Sl 结构域的序列，以及严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白的序 列。来自用RBD-Fc免疫的动物(例如，兔和小鼠)的抗体有效地阻滞严 重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中的RBD或Sl结构域同可 溶ACE2分子或细胞上表达的ACE2的结合。来自用RBD-Fc免疫的动物(例如，兔和小鼠)的抗体有效地中和 SARS-CoV和HIV/SARS-CoV S假病毒的感染，具有比由编码全长 SARS-CoV S蛋白的DNA疫苗和痘苗病毒载体诱导的小鼠抗血清的中和 滴度更高出约50-300倍的中和滴度。从抗血清中消除抗Fc抗体没有影响中和活性。这表明，严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中Sl结构 域上的RBD序列可以诱导高度有效的中和性抗体反应，并且可以被开发 成为用于预防SARS的有效的和安全的亚单位疫苗。连接RBD的IgG Fc可以显著地增强RBD的免疫原性，以产生高水 平的特异性针对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包括有效量的分离的多肽或重组蛋白的疫苗，其中所述分离的多肽或重组蛋白含有严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒突起蛋白中受体结合结构域的序列或其功能片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜世勃，何玉先，刘叔文，
申请(专利权)人：纽约血液中心，
类型：发明
国别省市：US[美国]