表皮生长因子与绿色荧光蛋白的融合蛋白制造技术

本发明专利技术属于生物学和生物医学领域，公开了一种融合蛋白，所述的融合蛋白的第一部分为绿色荧光蛋白或其活性片段；第二部分为表皮生长因子或其活性片段；更特别的，上述两个部分之间还包括一段适当长度的氨基酸连接子。本发明专利技术的融合蛋白可以用于表皮生长因子受体的内吞及其分子机理研究，以及表皮生长因子受体表达水平的检测等。本发明专利技术的融合蛋白在用于检测时敏感性好且无需避光操作，不存在放射等污染因素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和生物医学领域；具体地说，本专利技术涉及一种能高效与表皮生长因子受体结合的融合蛋白；本专利技术还涉及该蛋白的用途。
技术介绍
表皮生长因子(EGF)及表皮生长因子受体(EGFR)在人体许多细胞的生长、分化、增殖过程中起着重要的作用。表皮生长因子受体在很多肿瘤细胞中高表达，是肿瘤较理想的靶点。关于表皮生长因子受体的内吞及其信号转导的机理研究一直都是分子生物学和分子医学研究的热点之一，它也是肿瘤基因治疗、生物治疗的靶点。 表皮生长因子受体的内吞机理研究以往大多采用同位素标记的EGF，该种方法较为敏感，但是由于涉及到放射性物质，而且不能直观观察，不能在活体细胞上观察，所以难以广泛使用。 随着荧光标记物的发展，后来人们也采用了荧光标记的表皮生长因子(EGF)，这些荧光标记物大多是小分子化合物，如FITC，Rhodamine等。荧光化合物标记的EGF可以与EGFR结合并内吞，但是这些化合物的敏感度较低，荧光化合物容易见光淬灭，所以操作一定要避光，给操作带来了很多不便；此外荧光小分子化合物与EGF进行交联反映，也可能影响EGF的生物学活性，因此有必要寻找新的方法来解决这些问题。 绿色荧光蛋白(GFP，Green Fluorescent Protein)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP，Enhanced Green Fluorescent Protein)作为一种标记蛋白已被应用于分子生物学及医学研究。几年前有研究人员将GFP与Heregulin融合表达，结果发现融合蛋白可以与Heregulin受体结合。 虽然将绿色荧光蛋白(GFP)或者其它荧光蛋白与一个目标蛋白进行融合是一种已被应用的技术，但人们也了解这样的事实这种融合技术会影响被融合蛋白的固有折叠形式。GFP不仅仅能影响被融合对象的折叠形式，而且当GFP与一个自身折叠形式并不恰当的蛋白进行融合时，GFP的自身折叠形式也会遭受破坏，从而导致非正常性的弱荧光出现。 因此，GFP或EGFP并非适合于与各种蛋白相融合表达，并且，其与大多蛋白融合表达时往往会导致相应的蛋白活性发生变化，或空间结构发生变化，难以发挥这些蛋白质原先的各种特性，如结合特性等。迄今为止尚没有人实现对EGFP与EGF的融合蛋白进行表达纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白可很好地用于观察EGFR的内吞机理，检测细胞EGFR的表达状况，以及研究EGFR的信号转导机理等。 本专利技术的另一目的在于提供一种产生所述融合蛋白的方法。 在本专利技术的第一方面，提供一种分离的融合蛋白，所述的融合蛋白包括第一部分和第二部分，其中， 第一部分绿色荧光蛋白(或其活性片段)；和 第二部分表皮生长因子(或其活性片段)； 并且，所述的融合蛋白可与表皮生长因子受体结合。 在本专利技术的另一优选例中，所述的融合蛋白与表皮生长因子受体结合后可被细胞内吞。 在本专利技术的另一优选例中，所述的融合蛋白还可使表皮生长因子受体产生信号传导。 在本专利技术的一种优选例中，所述的绿色荧光蛋白为增效的绿色荧光蛋白。 在本专利技术的另一优选例中，所述的绿色荧光蛋白或其活性片段位于融合蛋白的氨基端；所述的表皮生长因子或其活性片段位于融合蛋白的羧基端。 在本专利技术的另一优选例中，在第一部分和第二部分之间，包括4-20个氨基酸的连接子。 在本专利技术的另一优选例中，所述的连接子的氨基酸序列为(GGGS)n，其中，n＝1～5。 更优选的，n＝1-4，更优选的，n＝2。 更优选的，所述的连接子具有SEQ ID NO10所述的氨基酸序列(即GGGSGGGS)。 在本专利技术的另一优选例中，在融合蛋白的氨基端设置有His6标签。 在本专利技术的另一优选例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。 在本专利技术的第二方面，提供一种核酸分子， (i)所述的核酸分子编码权利要求1所述融合蛋白；或 (ii)所述的核酸分子与(i)所述的核酸分子相互补。 在本专利技术的第三方面，提供一种载体，所述的载体中含有前面所述的核酸分子。 在本专利技术的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有前面所述的载体；或所述的细胞基因组中整合有前面所述的核酸分子。 在本专利技术的第五方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于 制备观察表皮生长因子的内吞及分子机理的物质；或 制备检测表皮生长因子受体的表达水平的物质。 在本专利技术的第六方面，提供一种产生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括培养前面所述的细胞，使所述细胞产生所述的融合蛋白。 在本专利技术的另一优选例中，还包括回收所述的融合蛋白；更优选的，包括分离和纯化所述的融合蛋白。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附图说明 图1显示了pET28a-EGFP-EGF载体示意图。 图2显示了采用SDS-PAGE凝胶电泳确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况。其中，泳道1为标准分子量标记(marker)的电泳情况；泳道2为用NTA-0缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道3为用NTA-40缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道4-5为用NTA-80缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道6-7为用NTA-100缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道8-9为用NTA-200缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道10为用NTA-250缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况； 图3显示了纯化后的EGFP-EGF蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。其中，泳道1为蛋白分子量标记，泳道2为0.5μg EGFP-EGF蛋白。 图4显示了EGFP-EGF蛋白与细胞表面EGFR结合及内吞图。其中， AEGFP-EGF蛋白的结合及内吞； BEGFP蛋白的结合及内吞； C用EGF蛋白竞争EGFP-EGF蛋白的结合及内吞。 图5显示了EGFP-EGF蛋白的内吞及其与网格蛋白(Clathrin)在细胞内共定位。 图6显示了EGFP-EGF蛋白的氨基酸序列。 具体实施例方式 本专利技术人经过长期的研究和试验，首次获得了表皮生长因子(EGF)与增效的绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)的融合蛋白。更特别的，本专利技术人在EGFP与EGF之间加上一段适当长度的连接子，从而大大提高融合蛋白与表皮生长因子受体的结合。本专利技术所形成融合蛋白可很好地用于研究EGFR的内吞机理，检测细胞EGFR的表达状况，研究EGFR的信号转导机理等。基于此完成了本专利技术。 含有(a)绿色荧光蛋白(更优选的为增效的绿色荧光蛋白)或其活性片段作为第一部分和(b)表皮生长因子或其活性片段作为第二部分的融合蛋白 本专利技术提供一种融合蛋白，该蛋白包括绿色荧光蛋白或其中的生物活性片段，和表皮生长因子或其中的生物活性片段，该分子能用于观察表皮生长因子受体的内吞及其信号转导的机理。更优选的，所述的融合蛋白是一种独立的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。 在本专利技术的优选方式中，所述的融合蛋白的分子量大约在38690道尔顿左右。 表皮生长因子 任何适合的表皮生长因子均可用于制备本专利技术的融合蛋白。本文使用的术语“表皮生长因子”是指一种多肽，能结合表皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括第一部分和第二部分，其中，第一部分：绿色荧光蛋白；和第二部分：表皮生长因子；并且，所述的融合蛋白可与表皮生长因子受体结合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李宗海，顾健人，蒋华，徐宇虹，
申请(专利权)人：上海市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]