与ＩＬ－１２结合的抗体及其纯化方法技术

本文公开了抗ＩＬ－１２抗体，包括其抗原结合部分。呈现了用于从样品基质中分离且纯化抗ＩＬ－１２抗体的一种或多种方法。这些分离的抗ＩＬ－１２抗体可以用于临床情况以及研究和开发中。还描述了包括分离的抗ＩＬ－１２抗体的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与IL-12结合的抗体及其纯化方法与相关申请的交叉参考本申请要求于2008年10月20日提交的美国临时申请系列号61/196，752的利益，其在此整体引入作为参考。
技术介绍
人白细胞介素12 (IL-12)已表征为具有独特结构和多效作用的细胞因子。IL-12在与涉及免疫和炎症应答的几种疾病相关的病理学中起关键作用。IL-12、其生物学活性及其在疾病中的作用的综述可以在Gately等人(1998)Ann. Rev. Immunol. 16:495-521中找到。在结构上，IL-12是包括35 kDa亚基(p35)和40 kDa亚基(p40)的异二聚体蛋白质，其通过二硫键连接在一起(被称为“P70亚基”)。异二聚体蛋白质主要由抗原呈递细胞产生，所述抗原呈递细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。这些细胞类型也分泌相对于 P70亚基过量的p40亚基。p40和p35亚基在遗传上无关，并且也未报道具有生物学活性， 尽管P40同二聚体可以充当IL-12拮抗剂。在功能上，IL-12在调节抗原特异性T辅助细胞型(Thl)和2型(Th2)淋巴细胞之间的平衡中起重要作用。Thl和Th2细胞支配自身免疫病症的起始和进展，并且IL-12在 Thl淋巴细胞分化和成熟的调节中是关键的。由Thl细胞释放的细胞因子是炎性的，并且包括干扰素-Y (IFNy ), IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13，以促进体液免疫、变态反应和免疫抑制。与自身免疫疾病中的Thl应答占优势和IFNy的促炎活性一致，IL-12可能在与许多自身免疫和炎性疾病相关的病理学中起主要作用，例如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)和Crohn氏病。具有MS的人患者已显示IL-12表达中的增加，如由急性MS斑中的p40 mRNA水平证明的。此外，用来自MS患者的CD40L表达性T细胞先体外后体内刺激抗原呈递细胞导致与对照T细胞相比较增加的IL-12生产，与⑶40/⑶40L相互作用是IL-12的有效诱导物的观察一致。与健康对照相比较，在RA患者的滑液中已检测到升高水平的IL-12 p70。在RA滑液中的细胞因子信使核糖核酸(mRNA)表达概况占优势地鉴定Thl细胞因子。IL-12还看起来在与Crohn氏病(CD)相关的病理学中起关键作用。在具有这种疾病的患者的肠粘膜中已观察到IFNy和IL-12增加的表达。来自⑶患者的固有层的T细胞的细胞因子分泌概况是占优势地Thl应答的特征，包括极大升高的IFNy水平。此外，来自⑶患者的结肠组织切片显示IL-12表达性巨噬细胞和IFNy表达性T细胞的丰度。由于人IL-12在多种人病症中的作用，已设计治疗策略以抑制或抵消IL-12活性。 具体地，已寻求与IL-12结合且中和IL-12的抗体作为抑制IL-12活性的方法。重要的是包括针对IL-12的抗体的治疗方案具有高纯度。本专利技术解决了这个需要，而无需使用A蛋白柱或等价的基于A蛋白的纯化步骤。专利技术概述在特定实施方案中，本专利技术涉及与IL-12结合的纯化、分离的抗体和抗体片段，以及包括此种抗体和片段的药物组合物。在特定实施方案中，本专利技术涉及与人IL-12结合的分离的抗体或其抗原结合部分。本专利技术的分离的抗IL-12抗体可以用于临床情况以及研究和开发中。在特定实施方案中，本专利技术涉及包括SEQ ID NOs. 1和2中鉴定的重和轻链序列的抗IL-12抗体。本专利技术的特定实施方案涉及从样品基质中纯化抗IL-12抗体或其抗原结合部分， 以使其基本上不含宿主细胞蛋白质(“HCPs”)的方法。在特定方面，样品基质(或简单地“样品”)包括用于产生本专利技术的抗IL-12抗体的细胞系。在具体方面，样品包括用于产生人抗 IL-12抗体的细胞系。在本专利技术的特定实施方案中，对包括推定的抗IL-12抗体或其抗原结合部分的样品基质实施PH调整。在特定方面，将pH调整至约3. 5。低pH尤其促进可能污染样品的pH 敏感病毒的减少和/或灭活。在合适的时间段后，将PH调整至约5. 0，并且对样品实施离子交换层析，以产生洗脱物。在特定方面，收集离子交换洗脱物，并且进一步实施疏水作用层析，以产生洗脱物。随后可以收集疏水作用层析洗脱物用于进一步加工或使用。在特定实施方案中，本专利技术提供了纯化IL-12抗体的方法，其包括初步回收步骤， 以尤其去除细胞和细胞碎片。在上述方法的特定实施方案中，初步回收步骤包括一个或多个离心或深层过滤(cbpth filtration)步骤。例如并且非限制性地，此种离心步骤可以以约7000 χ g至约11，000 χ g执行。此外，上述方法的特定实施方案将包括深层过滤步骤， 例如去脂(delipid)深层过滤步骤。在上述方法的特定实施方案中，离子交换步骤可以是阳离子或阴离子交换层析或两者的组合。这个步骤可以包括多个离子交换步骤，例如阳离子交换步骤随后为阴离子交换步骤，或反之亦然。在特定方面，离子交换步骤涉及两步骤离子交换过程。此种两步骤过程可以例如且不限于通过第一个阳离子交换步骤随后为第二个阴离子交换步骤来完成。示例性阳离子交换柱是其固定相包括阴离子基团的柱，例如CM Hyper DF 柱。这个离子交换捕获层析步骤促进从初步回收混合物中分离抗IL-12抗体。合适的阴离子交换柱是其固定相包括阳离子基团的柱。此种柱的例子是Q kpharose 柱。一个或多个离子交换步骤通过减少杂质进一步分离抗IL-12抗体，所述杂质如宿主细胞蛋白质和DNA以及在可应用时的亲和基质蛋白质。这个阴离子交换程序是层析的流通(flow through)模式，其中抗IL-12 抗体不与阴离子交换树脂(或固相)相互作用或结合。然而，许多杂质的确与阴离子交换树脂相互作用且结合。在特定实施方案中，在初步回收后执行第一个和第二个离子交换步骤。在特定此种实施方案中，对离子交换样品实施中间过滤步骤，在第一个离子交换步骤前，在2个离子交换步骤之间，或两者。在特定方面，这个过滤步骤包括捕获超滤/渗滤(“UF/DF”)。在其他活性中，此种过滤促进抗IL-12抗体及其抗原结合部分的浓缩和缓冲液更换。本专利技术的特定实施方案提供了包括一个或多个疏水作用层析(“HIC”)步骤的方法。合适的HIC柱是其固定相包括疏水基团的那种。此种柱的非限制性例子是Wienyl HP kpharose 柱。在特定情况下，抗IL-12抗体在分离/纯化过程期间将形成聚集体。一个或多个HIC步骤的包括促进此种聚集的减少或消除。HIC还帮助去除杂质。在特定实施方案中，HIC步骤采用高盐缓冲液，以促进抗IL-12抗体(或其聚集)与疏水柱的相互作用。抗 IL-12抗体随后可以使用较低浓度的盐进行洗脱。在特定实施方案中，HIC洗脱物使用病毒去除滤器进行过滤，例如但不限于 Ultipor DV50 滤器(Pall Corporation,East Hills，N. Y.)。可替代滤器例如 Viresolve 滤器(Millipore，Billerica, Mass. ) ；Zeta Plus VR 滤器(CUN0 ；Meriden, Conn.)；和 Planova 滤器(Asahi Kasei Pharma，Planova 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于从包括抗体和至少一种宿主细胞蛋白质（ＨＣＰ）的样品混合物中产生宿主细胞蛋白质减少的抗体制剂的方法，所述方法包括：（ａ）对所述样品基质实施ｐＨ的减少，从而形成初步回收样品，其中所述ｐＨ的减少是至３　–　４；（ｂ）将所述初步回收样品调整至约４．５　–　６的ｐＨ，随后将所述初步回收样品应用于离子交换树脂，且收集离子交换样品；（ｃ）将所述离子交换样品应用于疏水作用层析（ＨＩＣ）树脂且收集ＨＩＣ样品，其中所述ＨＩＣ样品包括所述ＨＣＰ减少的抗体制剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：RK希克曼，
申请(专利权)人：雅培制药有限公司，
类型：发明
国别省市：US