本发明专利技术公开了一种从江浙腹蛇蛇毒中逐级分离出的具有抗血栓活性的多肽序列，该多肽序列具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的氨基酸序列。试验证实，本发明专利技术多肽序列具有良好的抗血栓活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽序列，尤其涉及通过活性跟踪从江浙腹蛇蛇毒中逐级分离出的具有抗血栓活性的多肽序列，以及该多肽序列作为抗血栓剂的应用，属于生物医药领域。
技术介绍
蛇毒作为药物用于疾病治疗已有近2千年历史。在蛇毒治疗的一系列重大疾病中，血栓受到格外的重视。腹蛇蛇毒对血栓的确切作用使得“腹蛇抗栓酶”于二十世纪七十年代进入临床。“腹蛇抗栓酶”的活性成分是江浙腹蛇蛇毒，与其他蛇毒一样，江浙腹蛇蛇毒是诸多蛋白质的混合物。由于1970年代我国对申请上市新生化药和中药不要求定义实质上的活性成分及结构，所以“腹蛇抗栓酶”的活性成分到底是江浙腹蛇蛇毒中的什么蛋白，以及作为抗血栓活性蛋白的代表具有怎样的序列，至今都不清楚。1970年代以后，临床治疗和药物研究的要求逐步提高，寻找江浙腹蛇蛇毒的抗血栓活性成分，以及定义关键成分的序列具有明显的重要性。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种从江浙腹蛇蛇毒中分离出的具有良好抗血栓活性的多肽序列(f44)，该多肽序列具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。江浙腹蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒的分子量范围为2,000-100,000，本专利技术在Sephadex G-100凝胶色谱柱上将粗蛇毒干粉(简称f0)分离为4种组分(分别简称为f1、f2、f3、f4)，通过体外抗血小板聚集实验、半体内抗血小板聚集实验、小鼠尾动脉出血时间实验和125I标记的单克隆抗体结合实验测定f1-4的抗血小板聚集活性。通过这些体外测定，f4被确定为江浙腹蛇蛇毒抗血栓的活性部位。在上述基础上，本专利技术采用DEAE Saphdax-A-50阴离子交换树脂色谱柱将f4分离为4种组分(简称f41-4)，通过体外抗血小板聚集实验和体内抗血栓实验测定了f41-4的活性，确定f44为江浙腹蛇蛇毒中具有良好抗血栓活的组分。用AppliedBiosystems Procise-Procise 491/auto-PE491 Protein sequencer序列仪测定f44N末端的15个氨基酸序列，再按照常规方法将f44用胰蛋白酶酶解，进一步用反相高效液相质谱(RP-HPLC-MS)分析测定了f44的全氨基酸序列(SEQ ID NO.1)。本专利技术进一步测定了f44的体外抗血小板聚集活性和抗血栓活性，试验结果表明，f44具有良好的抗血小板聚集活性和抗血栓活性。本专利技术的目的之二是提供一种从江浙腹蛇粗蛇毒中分离出f44的方法，包括，将江浙腹蛇粗蛇毒干粉溶于水后上SephadexG-100凝胶色谱柱，用洗脱剂洗脱，收集馏份，将得到的馏份分别按流出时间(峰1RT＝0.8h；峰2RT＝1h；峰3RT＝1.3h；峰4RT＝2.3h)和对应的紫外峰(紫外峰吸收峰11000mAU；峰2480mAU；峰3250mAU；峰4180mAU)分成f1、f2、f3和f4共4个组分；将f4组分溶于水后上DEAE Saphdax-A-50阴离子交换树脂色谱柱，用洗脱剂洗脱，收集馏份，将得到的馏份按流出时间(峰1RT＝10min；峰2RT＝36min；峰3RT＝54min；峰4RT＝108min)和对应的紫外峰(紫外峰吸收峰1200mAU；峰2220mAU；峰3560mAU峰4500mAU)将f44从f4组分中分离出来。本专利技术的目的之三是提供一种药物组合物，该药物组合物由治疗上有效剂量的具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽和药学上可接受的载体或赋形剂组成。该药物组合物可按照生物制剂的常规方法制成临床上适宜的制剂，例如可以为口服制剂、注射或输液制剂等。附图说明图1 f1-4的SDS-PAGE电泳图谱。图2 f41-4的SDS-PAGE电泳图谱。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。应当指出，这些实施例仅仅是本专利技术的例证，不应理解为对本专利技术的限制。实施例1.江浙腹蛇粗蛇毒干粉(f0)的分离将0.1g粗蛇毒干粉(f0)(购自广西医学院蛇毒研究所)溶于2ml去离子水配成0.05g/ml的蛇毒水溶液。将得到的水溶液上到SephadexG-100凝胶色谱柱。色谱柱的直径为3.0cm、填料高度为100cm。色谱柱用NH4Ac水溶液(0.005mol/l)洗脱，洗脱剂的流速为0.5ml/min，在280nm处监测出峰情况并收集馏份。将得到的馏份按流出时间(峰1RT＝0.8h；峰2RT＝1h；峰3RT＝1.3h；峰4RT＝2.3h)和对应的紫外峰(紫外峰吸收峰11000mAU；峰2480mAU；峰3250mAU峰4180mAU)分成组份1-4个组分(简称f1-4)。上样100mg时的回收率如表1。f1-4的构成由电泳定义(图1)(SDS-PAGE，12.5％ Polyacrylamide gel；AmershamPharmacia Biotech AB生产的Hoefer mini VE电泳仪；Marker为AmershamPharmacia Biotech AB生产的Low molecular weight calibration kit，从小到大分子质量为14400、20100、30000、45000、66000和97000)。从图1可以看出，f1是大约含有6个条带的混合物，主要组分的分子量大约为60000道尔吨，其余分子量的条带都十分微弱。f2也是大约含有6个条带的混合物，主要组分的分子量也大约为60000道尔吨，只是分子量接近30000的2个条带的量明显比f1小。f3是大约含有5个条带的混合物，3个主要组分的分子量大约为16000、25000和31000道尔吨，其余分子量的条带都比较微弱。f4也是大约含有5个条带的混合物，3个主要组分的分子量大约为17000、20000和3 1000道尔吨，其余分子量的条带都比较微弱。表1使用Sephadex G-100色谱分离得到的蛇毒各组份 实施例2.f1-4的体外抗血小板聚集活性测定每个注射器中先吸入1ml枸橼酸钠(防止凝血)，每次取血30ml。每个离心管中，倒入5ml全血。平衡后离心，第一次以800r/min离心10min，得到富血小板血浆PRP。第二次3000R/min离心10min得到贫血小板血浆PPP。每个小管中加250ul PRP和一搅拌子，空白对照管中加250ul PPP和一搅拌子。30秒钟时，用注射器往小管中加f1-4，1分钟时用注射器加入诱导剂ADP(终浓度20μmol/L)、花生四烯酸(AA，500μmol/L)或者凝血酶(TH，0.2U/ml)，以二磷酸腺苷(ADP)和血小板活化因子(PAF)为诱导剂的小管4分钟后测定，以ADP为诱导剂的小管8分钟后测定，结果见表2-4。表2 f1-4在4种浓度下体外抗ADP诱导的家兔血小板聚集活性剂量(μg/ml)/抑制率 f1f2f3f46.25/4.1±2.2 12.50/9.03±6.125.0/15.0±8.85.0/15.6±7.9812.50/16.5±14.4 25.00/18.3±9.350.0/28.6±10.7 10.0/29.2±14.225.00/37.6±15.4 50.00/33.1±15.3 100.0/51.1±15.6 20.0/56.1±16.450本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有抗血栓活性的多肽序列ｆ４↓［４］，其具有ＳＥＱＩＤＮＯ．１所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭师奇，赵明，王超，王宇伟，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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