本发明专利技术涉及一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，包括：经一步溶剂热法合成得到表面柠檬酸钠稳定的超小Fe3O4纳米颗粒，然后将NH2-PEG-RGD修饰到纳米颗粒表面，得到RGD靶向的超小四氧化三铁MRI阳性分子探针。修饰了PEG-RGD的超小四氧化三铁纳米探针在小鼠体内具有长循环时间，并且在细胞水平和动物水平实现了对表面αvβ3整合素高表达癌细胞(U87MG细胞，人脑胶质瘤细胞)和皮下移植瘤的靶向T1加权增强MRI。本发明专利技术制备的Fe3O4纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。本发明专利技术制备方法简单，成本低，具有产业化和商业化潜能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于MRI纳米探针的制备领域，特别涉及一种RGD多肽靶向的超小四氧化 三铁MRI阳性纳米探针的制备方法。
技术介绍
癌症（cancer)，医学术语亦称恶性肿瘤，现在已直接或间接的影响许多人的生活， 成为威胁人类健康的头号杀手。因此，早期的诊断和治疗成为治愈癌症的关键。在肿瘤的 早期诊断方面，传统的影像技术只能了解肿瘤体积大小和解剖定位，而分子影像学技术可 以获得更多的检测参数，如肿瘤生长动力学评估、恶变前的分子异常检测、肿瘤细胞标记物 等，且活体分子成像可以实现在无损生物体微环境的状况下进行发病机制的研宄，并帮助 破译复杂的分子运动轨迹。目前应用于临床的分子影像学技术主要包括超声成像、核医学 PET成像、CT成像和MRI等。作为MRI分子影像学的重要组成部分，造影剂的适当选择可 以大大地提高成像诊断的灵敏性、特异性。而作为理想的且能应用于临床癌症早期靶向诊 断的纳米材料体系，在生物安全性得以保障的同时，更要兼顾能同时携带靶向分子、成像试 剂分子、制备方法简便、原材料价廉易得几个主要因素。目前应用于临床MRI的钆基小分 子造影剂都存在不可克服的缺陷，如血液循环时间过短、无组织特应性，尤其是钆基造影剂 一定浓度下还存在肾毒性。显而易见，金属或者金属氧化物纳米颗粒相对于金属离子螯合 物要更加具有安全性，并且一定尺寸的纳米颗粒经表面修饰后不仅能延长血液循环时间， 还能特异靶向肿瘤细胞或组织。至今已有大量文献报道利用磁性氧化铁纳米颗粒作为MRI 阴性造影剂应用于癌症的诊断。然而，在人体血液中、钙离子富集区、金属离子沉积以及人 体组织损伤部位在T2成像过程中也会出现信号减弱现象而得到负造影图像，这往往会干 扰临床诊断。因此，临床医学界更期望开发具有信号增强作用的T 1造影剂。已经有文献报 道可以利用超小氧化铁纳米颗粒作为T1增强的MRI造影剂，但其合成方法一般为油相高温 分解法，缺点是需要将颗粒从油相转入水相，而且很难在颗粒表面实施生物功能化（Sun et al. , J. Am. Chem. Soc. 2008, 7542 - 7543) 〇 检索国内外文献，尚没有发现关于用一步溶剂热法制备出超小四氧化三铁纳米颗 粒经PEG-RGD环状多肽靶向修饰的MRI阳性造影剂及其体内肿瘤模型靶向MRI诊断的相关 报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种R⑶多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性 纳米探针的制备方法。该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低，制备得到的 Fe3O4纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。 本专利技术的一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，包 括： (1)将六水合氯化铁溶解在一缩二乙二醇DEG中，然后加入柠檬酸钠 Na3Cit,在空 气气氛下60~80°C搅拌，柠檬酸钠完全溶解后加入无水醋酸钠，搅拌至醋酸钠粉末完全溶 解，将溶液转移至高压釜中，180~200°C反应3~4小时；自然冷却至室温，离心，弃上清 液，用无水乙醇回溶，重复操作2~3次，将沉淀物烘干，得到超小四氧化三铁纳米颗粒；其 中，六水合氯化铁、一缩二乙二醇、柠檬酸钠与无水醋酸钠的配比为1. 081~I. 09g :38~ 40mL :0· 47 ~0· 50g :1· 312 ~I. 33g ; (2)分别将Mal-PEG-NH2和巯基化的R⑶溶解于DMSO中，然后将溶解于DMSO中的 巯基化的RGD逐滴加入到Mal-PEG-My^ DMSO溶液中，持续搅拌反应60~72小时，反应结 束后透析，真空冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH2;其中，Mal-PEG-NH^ R⑶的摩尔比为1. 5~ 2 :1 ~1. 5 ; (3)将步骤（1)中的超小四氧化三铁纳米颗粒分散在DMSO中，超声，分别将EDC和 NHS的DMSO溶液加入到超小四氧化三铁纳米颗粒的DMSO的分散液中，搅拌反应2~3小 时，将反应结束后的溶液逐滴加入到步骤（2)中RGD-PEG-My^ DMSO溶液中反应60~72 小时，得到Fe3O4-PEG-RGD,透析，然后真空冷冻干燥，即得Fe 3O4-PEG-RGD ;其中，超小四氧化 三铁纳米颗粒、EDC与NHS的质量比为160~168 :134~144 :65~70。 所述步骤（1)中搅拌的时间为1~2小时。 所述步骤（1)中离心为8500rpm离心15分钟。 所述步骤（1)中烘干温度为60°C。 所述步骤（2)中所采用的PEG为一端氨基另一端为马来酰亚胺基团，分子量为 2000 〇 所述步骤（2)中透析时用截留分子量为2000的透析袋透析3天，每次透析所用蒸 馏水2L，共换水9次。 所述步骤（3)中透析时用截留分子量为8000~14000的透析袋透析3天，每次透 析所用蒸馏水2L，共换水9次。 柠檬酸钠是一种小分子羧酸盐，拥有三个羧基，被广泛地应用于纳米材料合成过 程中的晶体生长抑制剂和稳定剂，不仅能提供影响纳米颗粒胶体稳定性的电荷排斥力，还 使得纳米颗粒表面带上负电荷的羧基官能团，为纳米颗粒的表面多功能修饰提供了可行 性。本专利技术选取的靶向分子环状RGD多肽，具有分子量小、无毒、无免疫原性、生物相容性好 等多种优势。并且，前期的研宄成果显示经一步水热法合成得到的氧化铁经PEG修饰后在 体内可以保持长的血液循环时间（Li et al. ,Biomaterials 34(2013)8382-8392)。正是基 于氧化铁纳米颗粒选材廉价、安全性高、易于制备以及前期在纳米颗粒表面修饰的基础上， 本专利技术采用了类似的方法（一步溶剂热法）合成出具有良好胶体稳定性的超小Fe 3O4纳米 颗粒。随后，Fe3O4纳米颗粒表面的NH 2-PEG-R⑶修饰不仅增加了纳米颗粒的水溶性和生物 相容性，同时也提高了 Fe3O4纳米颗粒对肿瘤细胞或肿瘤部位的靶向性，从而获得T i增强的 MRI纳米探针，用于表面α νβ 3整合素高表达癌细胞和肿瘤的特异性MRI诊断。 本专利技术先利用一步溶剂热法合成柠檬酸钠稳定的Fe3O4磁性纳米颗粒，然后将 NH2-PEG-RGD修饰在纳米颗粒的表面。 本专利技术操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳 定性和生物相容性。与没有RGD修饰的对照材料相比，修饰RGD的Fe 3O4纳米颗粒对肿瘤细 胞或肿瘤部位具有更好的革G向性。该方法制备的RGD革El向超小Fe3O4纳米颗粒在MRI分子 影像诊断领域有着潜在的应用。 本专利技术使用核磁共振波谱（1H NMR)、红外（FTIR)、热重分析（TGA)、电感耦合等离 子体原子发射光谱法（ICP-OES)、Zeta电势、水合粒径等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并 通过MRI成像仪测定纳米颗粒的T 1成像性能和r i弛豫率，然后通过溶血实验、MTT法和相 差显微镜观察法评价纳米颗粒的血液相容性和细胞毒性，再利用普鲁士蓝染色法和电感耦 合等离子体原子发射光谱法验证U87MG细胞对纳米颗粒的吞能力和修饰RGD后的祀向能 力，体外和体内MRI实验检测RGD修饰的纳米材料对肿瘤细胞的靶向诊断效果。具体测试 结果如下： (1)核磁共振分析（1H WR)的测试结果 通过分析RGD-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，包括：(1)将六水合氯化铁溶解在一缩二乙二醇DEG中，然后加入柠檬酸钠Na3Cit，在空气气氛下60～80℃搅拌，柠檬酸钠完全溶解后加入无水醋酸钠，搅拌至醋酸钠粉末完全溶解，将溶液转移至高压釜中，180～200℃反应3～4小时；自然冷却至室温，离心，弃上清液，用无水乙醇回溶，重复操作2～3次，将沉淀物烘干，得到超小四氧化三铁纳米颗粒；其中，六水合氯化铁、一缩二乙二醇、柠檬酸钠与无水醋酸钠的配比为1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g；(2)分别将Mal‑PEG‑NH2和巯基化的RGD溶解于DMSO中，然后将溶解于DMSO中的巯基化的RGD逐滴加入到Mal‑PEG‑NH2的DMSO溶液中，持续搅拌反应60～72小时，反应结束后透析，真空冷冻干燥，得到RGD‑PEG‑NH2；其中，Mal‑PEG‑NH2与RGD的摩尔比为1.5～2：1～1.5；(3)将步骤(1)中的超小四氧化三铁纳米颗粒分散在DMSO中，超声，分别将EDC和NHS的DMSO溶液加入到超小四氧化三铁纳米颗粒的DMSO的分散液中，搅拌反应2～3小时，将反应结束后的溶液逐滴加入到步骤(2)中RGD‑PEG‑NH2的DMSO溶液中反应60～72小时，得到Fe3O4‑PEG‑RGD，透析，然后真空冷冻干燥，即得Fe3O4‑PEG‑RGD；其中，超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC与NHS的质量比为160～168：134～144：65～70。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：史向阳，罗宇，张贵祥，杨嘉，
申请(专利权)人：东华大学，上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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