一种制备链霉菌全蛋白的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种制备链霉菌全蛋白的方法。本发明专利技术的分离制备链霉菌全蛋白的方法简单易行，利用所述的方法，链霉菌蛋白样品分离效果良好，可尽可能完整地得到细胞所表达的全蛋白，在制备过程中不发生明显的蛋白降解现象。利用本发明专利技术制备的链霉菌全蛋白，可获得高质量且重复性好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析，具有极大的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及一种制备链霉菌全蛋白 的方法。
技术介绍
链霉菌是一类土壤微生物，呈丝状生长，具有复杂的生化和形态学分化特 征，因能合成品种繁多的药用抗生素而受到广泛的关注。近来，包括天蓝色链 霉菌和阿维链霉菌在内的链霉菌全基因组测序工作的完成为系统研究这些工 业菌株的基因组特性铺平了道路。实现这个目标最合适的途径就是通过双向电 泳技术分离和展现细胞粗提物并用质谱技术鉴定所分离到的蛋白。目前，已有包括天蓝色链霉菌在内的一些链霉菌种的相关蛋白质组的分析 报道，所用到的蛋白质提取方法主要包括非变性法和变性法两种。非变性法通 常包括透析除盐和低压冻干浓縮两个步骤；变性法是通过添加化学试剂使蛋白 变性而沉淀以达到去除杂质和浓縮的目的，此类化学试剂包括丙酮、三氯乙酸 (TCA)、去氧胆酸钠(D0C)、 PEG6000等。虽然有一定数量的文献关注于双向电泳样品制备方法的改进，但所分离得 到的蛋白质数量有限，尤其是一些低丰度蛋白。更重要的，已有的有关链霉菌 蛋白质组学分析的报导中所用到的培养基多为合成培养基或商品化的可溶性 复合培养基。工业级的复合培养基发酵过程中，因细胞富含多糖、核酸以及多 种次级代谢物等干扰双向电泳过程的杂质，目前还没有简单有效的制备链霉菌 全蛋白样品用于双向电泳的方法和技术，从而使相关的蛋白质组研究相对基因 组研究工作比较滞后。选择合适的样品制备方法是决定蛋白质组研究成败的关 键步骤。细胞必须进行有效的破碎，同时还要去除杂质并尽量避免蛋白样品的 降解。因此，本领域迫切需要开发出简单有效的制备链霉菌全蛋白样品的方法， 以满足研究所需
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。在本专利技术的第一方面，提供一种制备链霉菌全蛋白样品的方法，所述方法包 括以下步骤(1) 将链霉菌细胞液氮研磨成干粉，将干粉加入Tris-HC1缓冲液，获得蛋 白粗提液；(2) 将步骤(l)获得的蛋白粗提液加入三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液中，低温 (优选约-2(TC)沉淀，收集蛋白沉淀；(3) 将步骤(2)获得的蛋白沉淀加入丙酮，超声波洗涤蛋白沉淀，收集经洗涤的蛋白沉淀，千燥；(4) 溶解步骤(3)获得的经干燥的蛋白沉淀，获得链霉菌全蛋白样品。 在另一优选例中，在步骤(1)中，所述的蛋白粗提液中还加入蛋白酶抑制剂，所述的蛋白酶抑制剂含有乙二胺四乙酸(EDTA)，苯甲基磺酰氟(PMSF)， 抑氨肽酶B素(Bestatin)和胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)。在另一优选例中，在步骤(1)中，干粉加入含有蛋白酶抑制剂的Tris-HCl 缓冲液后，充分混匀，离心，上清即为蛋白粗提液。更优选的，离心的条件是 4±2°C， 30000士10000g离心40±10分钟。更优选的，取上清时，排除悬浮于 液体表面的脂类物质。在另一优选例中，在步骤(2)中，所述的三氯乙酸/丙酮溶液中三氯乙酸 的浓度是10-20wt% 。在另一优选例中，在步骤(2)中，所述的三氯乙酸/丙酮溶液中还含有 10-50mM(优选20-40mM;最优选约20mM)的二硫苏糖醇(DTT)。在另一优选例中，在步骤(2)中，以体积计，三氯乙酸/丙酮溶液的加入 量是蛋白粗提液的2-5倍。在另一优选例中，在步骤(3)中，超声波洗涤的条件为30土10W， 30± 10s，脉冲，处理1-5次。在另一优选例中，超声波洗涤时，超声波的振幅为50±20%;优选的是50 ±10%;更优选的是50±5%。在另一优选例中，在步骤(4)中，将步骤(3)获得的经干燥的蛋白沉淀溶解于泡胀液(或称再水化液)中，离心，上清即为链霉菌全蛋白样品；其中，所述的泡胀液含有5-10M (优选6-8M)尿素，20-40g/L (也即2-4% (w/v)) 3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)， 10-50mM 二硫苏糖醇(优 选为20-40mM;最优选约20mM)， 10-20g/L (也即1-2%(w/v)) pH3-10的两性 电解质；并且，所述的泡胀液中基本上不含有硫脲。在另一优选例中，所述的泡胀液中还含有痕量的溴酚蓝，如0.002°/。(体积) 的溴酚蓝。在另一优选例中，所述的泡胀液由尿素，CHAPS， DTT， pH3-IO的两性电解 质组成。在另一优选例中，在步骤(4)中，离心的条件是15±2°C， 40000士10000g 离心60±15分钟。在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括将获自链霉菌培养物的链霉菌 细胞进行水洗涤；更优选的，将洗涤后的细胞于4±2°C， 12000士3000g离心 3-5min以除去多余水分。在本专利技术的第二方面，提供一种蛋白酶抑制剂，所述的蛋白酶抑制剂含有 乙二胺四乙酸(EDTA)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，抑氨肽酶B素(Bestatin)和胃 蛋白酶抑制剂(P印statin)。在另一优选例中，所述的蛋白酶抑制剂由乙二胺四乙酸，苯甲基磺酰氟， 抑氨肽酶B素和胃蛋白酶抑制剂组成。在另一优选例中，所述的蛋白酶抑制剂中各组分的摩尔比例是乙二胺四乙酸苯甲基磺酰氟抑氨肽酶B素胃蛋白酶抑制剂=(4± 2) : (6±2) : (0. 02±0. 01) : (0. 03±0. 01)。在另一优选例中，所述的蛋白酶抑制剂用于防止链霉菌全蛋白中各蛋白被 降解。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。 附图说明图1显示了阿维链霉菌全蛋白样品双向电泳图谱；其中，MW为蛋白质分 子量标准，单位是KDa。图2显示了糖多孢链霉菌全蛋白样品双向电泳图谱。图3显示了改变细胞破碎方法后制备的阿维链霉菌全蛋白样品的双向电 泳图谱。图4显示了经洗涤千燥的蛋白沉淀用泡胀液溶解后，离心条件采用为 15°C， 18000g， 30min，最终获得的阿维链霉菌全蛋白样品的双向电泳图谱。图5显示了在制备过程中采用含7M尿素、2M硫脲、2。/。(w/v)CHAPS、lX(v/v) 两性电解质(pH3-IO)和20mM DTT以及痕量溴酚蓝的泡胀液溶解蛋白沉淀，最 终获得的阿维链霉菌全蛋白样品的双向电泳图谱。具体实施方式本专利技术人经过长期的研究，开发出一种效果优异的制备链霉菌全蛋白的方 法，利用所述的方法，链霉菌蛋白样品分离效果非常理想，可尽可能完整地得 到细胞所表达的全蛋白，在制备过程中不发生明显的蛋白降解现象。在此基础 上完成了本专利技术。制备链霉菌全蛋白的方法本专利技术所述的制备链霉菌全蛋白样品的方法，包括以下步骤(1) 将链霉菌细胞液氮研磨成干粉，将干粉加入Tris-HC1缓冲液，获得蛋 白粗提液；(2) 将步骤(l)获得的蛋白粗提液加入TCA/丙酮溶液中，低温沉淀，收集蛋 白沉淀；(3) 将步骤(2)获得的蛋白沉淀加入丙酮，超声波洗涤沉淀，收集经洗涤的蛋 白沉淀，干燥；(4) 溶解步骤(3)获得的经干燥的蛋白沉淀，获得链霉菌全蛋白样品。 细胞被有效地破碎是制备链霉菌全蛋白的关键步骤，也是获得完整的全蛋白的前提。在本专利技术的方法中，将链霉菌细胞液利用液氮研磨形成干粉，然后 加入到缓冲液中，获得蛋白粗提液。本专利技术人发现，液氮研磨具有特别优异的 破碎链霉菌细胞的效果，采用该方法在彻底破碎细胞的同时，对细胞内的蛋白造成最小的损伤。而其它细胞破碎方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备链霉菌全蛋白样品的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（１）将链霉菌细胞液氮研磨成干粉，将干粉加入Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液，获得蛋白粗提液；（２）将步骤（１）获得的蛋白粗提液加入三氯乙酸／丙酮溶液中，低温沉淀，收集蛋白沉淀；（３）将步骤（２）获得的蛋白沉淀加入丙酮，超声波洗涤蛋白沉淀，收集经洗涤的蛋白沉淀，干燥；（４）溶解步骤（３）获得的经干燥的蛋白沉淀，获得链霉菌全蛋白样品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王永红，银鹏，张嗣良，庄英萍，储炬，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]