寡核苷酸组合物及其制备方法技术

本公开提供一种经由依次偶联循环来制备寡核苷酸的固相方法，所述方法包括二核苷酸二聚体亚基至少一次偶联于生长链的游离3'‑端基。所述寡核苷酸包含至少两个通过N3′→P5′磷酰胺酯键联连接的核苷亚基。所述方法可包括以下步骤：(a)使连接于固相支撑物的末端核苷的受保护的3'氨基脱保护，所述脱保护形成游离3'氨基；(b)使所述游离3'氨基与3'‑受保护的氨基‑二核苷酸‑5'‑亚磷酰胺二聚体在亲核催化剂存在下接触以形成核苷间N3’→P5’亚磷酰胺键联；以及(c)使所述键联氧化(例如硫化)。通过主题方法产生的组合物可包含降低量的一种或多种(N‑x)寡核苷酸产物。还提供包含主题寡核苷酸组合物的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2014年5月1日提交的美国临时申请序列第61/987,396号和2015年4月23日提交的美国临时申请序列第62/151,909号(代理人参考第185/002X号)的申请日的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。引言核酸聚合物化学已在医药、诊断和分析领域且更具体地说在反义和抗基因治疗学、组合化学、分支DNA信号放大以及基于阵列的DNA诊断学和分析中的许多开发中的技术中起作用。一些这种聚合物化学已涉及改进天然核酸聚合物如DNA的结合强度、特异性和核酸酶抗性。肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酰胺酯核苷间键联是已应用至寡核苷酸以提供一种或多种期望性质如核酸酶抗性、细胞摄取和溶解性的一些聚合物化学的实例。寡核苷酸N3'→P5'磷酰胺酯可与互补DNA和RNA链形成稳定双链体，以及与DNA双链体形成稳定三链体，并且对核酸酶具有抗性。已发现寡核苷酸N3'→P5'硫代磷酰胺酯在体外和体内用作有效反义剂。例如，含有抑制端粒酶活性的化合物的寡核苷酸可用于治疗端粒酶介导的病症(如癌症)，因为癌细胞表达端粒酶活性且正常人类体细胞不具有生物学相关水平下的端粒酶活性。因此，制备和分离此类寡核苷酸的方法是令人感兴趣的。概述本公开提供一种经由依次偶联循环制备寡核苷酸的固相方法，所述方法包括二核苷酸二聚体亚基至少一次偶联至生长链的游离3’-端基(例如，3’-羟基或3’-氨基)。主题方法包括制备寡核苷酸，其中至少两个核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。所述方法可包括以下步骤：(a)使连接至固相支撑物的末端核苷的受保护的3'氨基脱保护，所述脱保护形成游离3'氨基；(b)使所述游离3'氨基与3'-保护的氨基-二核苷酸-5'-亚磷酰胺二聚体在亲核催化剂存在下接触以形成核苷间N3'→P5'亚磷酰胺键联；以及(c)使所述键联氧化。在一些情况下，使所述键联氧化包括硫化以产生核苷间N3'→P5'硫代磷酰胺酯键联。本公开的方面包括通过主题方法产生的寡核苷酸组合物，所述组合物包含减少量的一种或多种(N-x)寡核苷酸产物。在一些情况下，所述减少量是相对于N产物少于一种或多种(N-x)产物的(1.9xN)重量份至100重量份。根据主题方法制备的寡核苷酸包括具有与人端粒酶的RNA组分互补的N核苷亚基的序列的寡核苷酸，其中至少两个核苷亚基通过N3′→P5′硫代磷酰胺酯亚基间键联连接。还提供包含主题寡核苷酸组合物的药物组合物。附图简述图1A和1B示出TA二聚体硫代磷酰胺酯(化合物7e，方案1)的HPLC色谱图(A)和31PNMR谱(B)。图2A和2B示出AA二聚体硫代磷酰胺酯(化合物7a，方案1)的HPLC色谱图(A)和31PNMR谱(B)。图3A和3B示出GG二聚体硫代磷酰胺酯(化合物7c，方案1)的HPLC色谱图(A)和31PNMR谱(B)。图4A和4B示出GT二聚体硫代磷酰胺酯(化合物7d，方案1)的HPLC色谱图(A)和31PNMR谱(B)。图5A和5B示出GA二聚体硫代磷酰胺酯(化合物7b，方案1)的HPLC色谱图(A)和31PNMR谱(B)。图6A和6B示出二聚体酰胺化物TA、AA、GA、GT和GG的LCMS迹线。图7示出使用单体偶联策略，伊美司他的140μmole规模合成的产物的HPLC色谱图。图8示出使用二聚体嵌段偶联策略，伊美司他的140μmole规模合成的产物的HPLC色谱图。定义除非另外指示，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语具有其领域公认的含义。如本文所用，术语多核苷酸和寡核苷酸可互换使用。每当寡核苷酸由诸如“ATGUCCTG”的字母序列表示时，除非另外指示，否则应理解核苷酸是呈从左至右的5'→3'顺序，且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，且“U”表示脱氧尿苷。如本文所用，“核苷”包括天然核苷，包括2'-脱氧和2'-羟基形式，例如如Kornberg和Baker,DNAReplication,第2版(Freeman,SanFrancisco,1992)中所描述。提及核苷的“类似物”包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷，例如通常由Scheit,NucleotideAnalogs(JohnWiley,NewYork,1980)描述。所述类似物包括经设计以增强结合性质(例如稳定性、特异性等)的合成核苷，如由Uhlmann和Peyman(ChemicalReviews,90:543-584,1990)所公开。在一些实施方案中，核苷或核苷类似物包括3’-羟基或3’-氨基。术语“碱基”和“核碱基”可互换使用且在本文定义为包括(i)常规DNA和RNA碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶)，和(ii)修饰的碱基或碱基类似物(例如，5-甲基-胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或肌苷)。碱基类似物是其分子结构模拟常规DNA或RNA碱基的分子结构的化学品。如本文所用，“嘧啶”意指存在于天然核苷中的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以及其共同类似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羟基、氨基、硫代、卤代等取代基的那些。如本文所用的术语还包括具有连接的常见保护基的嘧啶，如N4-苯甲酰基胞嘧啶。其他常见的嘧啶保护基由Beaucage和IyerTetrahedron48:2223-2311(1992)公开。如本文所用，“嘌呤”意指存在于天然核苷中的嘌呤，包括腺嘌呤、鸟嘌呤和次黄嘌呤以及其共同类似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羟基、氨基、硫代、卤代等取代基的那些。如本文所用的术语还包括具有连接的常见保护基的嘌呤，如N2-苯甲酰基鸟嘌呤、N2-异丁酰基鸟嘌呤、N6-苯甲酰基腺嘌呤等。其他常见的嘌呤保护基由Beaucage和IyerTetrahedron48:2223-2311(1992)公开。如本文所用，作为化学名称的组成部分的术语“-受保护的-”是指本领域公认的用于化合物的特定部分的保护基，例如关于核苷之“5'-保护的-羟基”包括三苯基甲基(即三苯甲基)、对茴香基二苯基甲基(即单甲氧基三苯甲基或MMT)、二-对茴香基苯基甲基(即二甲氧基三苯甲基或DMT)等；且关于核碱基的受保护的核碱基包括用如二甲基氨基甲脒(DMF)、苯甲酰基(Bz)、异丁酰基等基团保护的杂原子。本领域公认的保护基包括在以下参考文献中描述的那些保护基：Gait编辑,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,1984)；Amarnath和Broom,ChemicalReviews,77:183-217,1977；Pon等人,Biotechniques,6:768-775,1988；Ohtsuka等人,NicleicAcidsResearch,10:6553-6570,1982；Eckstein编辑,Oligonucleotides.andAnalogues:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,1991)；Greene和Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第2版(J本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其具有相对于化合物或其盐少于4重量份中1重量份的(N‑1)产物，其中所述化合物包含具有10个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸，并且至少两个所述核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.01 US 61/987,396;2015.04.23 US 62/151,9091.一种组合物，其具有相对于化合物或其盐少于4重量份中1重量份的(N-1)产物，其中所述化合物包含具有10个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸，并且至少两个所述核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联是具有以下结构的N3′→P5′硫代磷酰胺酯亚基间键联：3′—NH—P(S)(OR)—O—5’其中R选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保护基，或其盐。3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述化合物包含具有10个或更多个与人端粒酶的所述RNA组分互补的核苷亚基的序列的多核苷酸。4.如权利要求3所述的组合物，其中所述多核苷酸包含含有13个或更多个与人端粒酶的所述RNA组分互补的核苷亚基的序列。5.如权利要求3所述的组合物，其中所述多核苷酸包含在3个与50个之间的与人端粒酶的所述RNA组分互补的连续核苷亚基。6.如权利要求3-5中任一项所述的组合物，其中与人端粒酶的所述RNA组分互补的所述核苷亚基均通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：GTTAGGGTTAG(SEQIDNO:4)、TAGGGTTAGACAA(SEQIDNO:3)和CAGTTAGGGTTAG(SEQIDNO:5)。8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含3’氨基或3’-羟基端基。9.如权利要求7所述的组合物，其中所述化合物具有结构：或其盐；其中“nps”表示使一个核苷的3'-碳连接于相邻核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯键联—NH—P(═O)(SH)—O—。10.如权利要求9所述的组合物，其中所述盐是药学上可接受的盐。11.如权利要求7所述的组合物，其中所述化合物具有结构：其中各Mx+独立地是氢或盐的抗衡离子，各x独立地是1、2或3，且n是5至13的整数。12.如权利要求7所述的组合物，其中所述化合物具有结构：13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于6重量份中1重量份的(N-1)产物。14.如权利要求13所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于10重量份中1重量份的(N-1)产物。15.如权利要求14所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于20重量份中1重量份的(N-1)产物。16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于4重量份中1重量份的任何(N-x)产物。17.如权利要求16中任一项所述的组合物，其具有相对于所述化合物少于总共100重量份中40重量份的(N-x)含多核苷酸产物。18.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其具有(N-x)含多核苷酸产物的以下概况：相对于所述化合物少于4重量份中1重量份的(N-1)产物；相对于所述化合物至少100重量份中10重量份的(N-2)和(N-3)产物。19.一种化合物活性药物成分，其具有少于11重量％的(N-1)产物，其中所述化合物或其药学上可接受的盐包含具有10个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列的多核苷酸，其中至少两个所述核苷亚基通过N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联连接。20.如权利要求19所述的化合物活性药物成分，其中与人端粒酶的所述RNA组分互补的所述核苷亚基均通过N3′→P5′硫代磷酰胺酯亚基间键联连接。21.如权利要求19-20中任一项所述的化合物活性药物成分，其中所述N3′→P5′磷酰胺酯亚基间键联是具有以下结构的N3′→P5′硫代磷酰胺酯亚基间键联：3′—NH—P(S)(OR)—O—5’其中R选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保护基，或其药学上可接受的盐。22.如权利要求19-21中任一项所述的化合物活性药物成分，其中所述多核苷酸包含在10个与50个之间的与人端粒酶的所述RNA组分互补的连续核苷亚基。23.如权利要求19-22中任一项所述的化合物活性药物成分，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：GTTAGGGTTAG(SEQIDNO:4)；TAGGGTTAGACAA(SEQIDNO:3)；以及CAGTTAGGGTTAG(SEQIDNO:5)。24.如权利要求19-23中任一项所述的化合物活性药物成分，其中所述多核苷酸包含3’氨基或3’-羟基端基。25.如权利要求19-23中任一项所述的化合物活性药物成分，其中所述化合物具有结构：或其药学上可接受的盐；其中“nps”表示使一个核苷的3'-碳连接于相邻核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯键联—NH—P(═O)(SH)—O—。26.如权利要求19-23中任一项所述的化合物活性药物成分，其中所述化合物具有结构：其中各Mx+独立地是氢或药学上可接受的盐的抗衡离子，各x独立地是1、2或3，且n是5至13的整数。27.如权利要求26所述的化合物活性药物成分，其中所述化合物具有结构：28.如权利要求19-27中任一项所述的化合物活性药物成分，其具有少于9重量％的所述(N-1)产物。29.如权利要求28所述的化合物活性药物成分，其具有少于5重量％的所述(N-1)产物。30.如权利要求19-29中任一项所述的化合物活性药物成分，其具有少于11％的任何(N-x)产物。31.如权利要求19-30中任一项所述的化合物活性药物成分，其具有少于总共45重量％的(N-x)含多核苷酸产物。32.如权利要求19所述的化合物活性药物成分，其具有(N-x)含多核苷酸产物的以下概况：少于5重量％的(N-1)产物；以及至少10重量％的(N-2)和(N-3)产物。33.一种药物组合物，其包含于药学上可接受的赋形剂中配制的如权利要求1-18中任一项所述的组合物。34.一种合成多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使连接于固相支撑物的末端核苷的受保护的3'氨基脱保护，所述脱保护形成游离3'氨基；(b)使所述游离3'氨基与3'-受保护的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亚磷酰胺二聚体在亲核催化剂存在下接触以形成核苷间N3’→P5’亚磷酰胺键联；以及(c)使所述键联氧化。35.如权利要求34所述的方法，其进一步包括：(a)使连接于固相支撑物的末端核苷的受保护的3'氨基脱保护，所述脱保护形成游离3'氨基；(b)使所述游离3'氨基与3'-受保护的氨基核苷-5'-亚磷酰胺单体在亲核催化剂存在下接触以形成核苷间N3’→P5’亚磷酰胺键联；以及(c)使所述键联氧化。36.如权利要求34和35中任一项所述的方法，其中使所述键联氧化包括硫化以产生硫代磷酰胺酯键联。37.如权利要求34和35中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·H·拉米亚，
申请(专利权)人：美国杰龙生物医药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US