制备小粒径脂质体的方法技术

制备具有特定粒径的脂质体，通过基本持续地混合基本上持续的水流和基本上持续的有机溶剂流，所述有机溶剂包含能形成脂质体的脂质，并冷却所述混合物以形成脂质体，控制水流流速对有机溶剂流的流速之比以及所述混合物的冷却速度以使获得至少约90％的脂质体的粒径小于约200nm。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为200980150953.3(国际申请号为PCT/US2009/068499)、申请日为2009年12月17日、专利技术名称为“制备小粒径脂质体的方法”的中国专利申请的分案申请。本申请主张在35USC119(c)以及巴黎公约条件下美国临时申请61/138,353的权益，所述临时申请于2008年12月17日申请，并全文引入本申请作为参考。
本专利技术主要涉及脂质体疫苗生产领域。
技术介绍
关于小粒径脂质体的制备，现有技术采用直接将预置好的大量体积的水与脂质/溶剂混合，即从一个大桶装入另一个大桶中(例如，美国专利申请No.11/185,448)，的封闭低效的系统。现有技术装置将加压脂质/溶剂溶液通过分散小孔或微米级小洞以加压脂质/溶剂喷雾形式进入水流(例如，美国专利US6,843,942，Wagner等，2002，Journal ofLiposome Research，12(3)，第259-270页，美国专利US6,855,277)。现有技术需要匀质化或超声处理(例如美国专利US6,855,277)来制备具有限定且均匀粒径范围的脂质体。
技术实现思路
本专利技术旨在提供粒径小于约200nm的脂质体。令人惊奇地发现，在制备脂质体的方法中，若其包含将有机液体(其中溶有脂质)与水混合的步骤，那么有机溶剂的浓度和所产生的混合物的迅速冷却对形成并保持一致的脂质体粒径至关重要。本申请的方法与装置有助于商业化大规模生产包封了药物的匀质脂质体疫苗制剂，即在新颖的条件下，将脂质溶液，其含有溶入与水互溶的有机溶剂中的脂质，混入流动的水中，以促进疫苗质量级别的脂质体不断生成。所述方法使用一种连续混合系统，其中流速比，即脂质溶液流速与水流速之比，保持恒定，由此保持系统中恒定的有机溶剂百分比。所述方法更进一步用一种快速且规模依赖性的冷却步骤，其在脂质体形成后使用并防止脂质体平均粒径的增长。所述方法还进一步提供一种管道排布方法，其促进形成具有理想粒径的脂质体。为制备粒径小于约200nm的脂质体，依照本申请的方法，有机溶剂/水混合物中的有机溶剂浓度保持在5％到30％之间，更优选地，在10％到25％之间，最优选地，在10％到25％之间；流速比(水侑机溶剂)保持在19∶1到3又1/3∶1之间，更优选地在9∶1到5∶1之间，或在9∶1到4∶1之间；且脂质体混合物的冷却(从约55℃至约30℃)时间少于5小时，更优选地少于2小时，最优选地少于30分钟，更优选基本上即时冷却。本专利技术解决了领域内的难题，即批次间的差异性、在冷却中出现的脂质体粒径不期望的增长以及需要诸如超声或增压系统等精密方法。依照本专利技术制得的脂质体适用于制造人用或兽用疫苗。本专利技术提供以下技术方案：1.制备具有一定粒径的脂质体制剂的方法，所述方法包含步骤a)提供基本上持续的水流，b)提供基本上持续的有机溶剂流，所述有机溶剂包含溶于其中的至少一种脂质，所述脂质能形成脂质体，c)将所述水流和有机溶剂流基本持续地混合，以得到混合物，且d)冷却所述混合物，且e)使所述混合物内部形成脂质体，控制水流的流速对有机溶剂流的流速之比以及所述混合物的冷却速度以获得至少约90％的脂质体的粒径小于约200nm的脂质体制剂。2.技术方案1所述的方法，其中水流的流速对有机溶剂流的流速之比至少为约2∶1。3.技术方案1所述的方法，其中水流的流速对有机溶剂流的流速之比不高于约19∶1。4.技术方案1所述的方法，其中水流的流速对有机溶剂流的流速之比至少为约3∶1且不高于约19∶1。5.技术方案1所述的方法，其中水流的流速对有机溶剂流的流速之比至少为约3∶1且不高于约9∶1。6.技术方案1所述方法，其中水流的流速对有机溶剂流的流速之比为约4∶1。7.技术方案1-6任一项所述的方法，其中冷却速度平均为每小时至少约4℃。8.技术方案1-7任一项所述的方法，其中所述的混合物在不多于约2小时内被冷却至少约20℃。9.技术方案1-8任项所述的方法，其中所述有机溶剂流在所述混合之前，处于比所述脂质的转变温度至少高10℃的温度下。10.技术方案1-9任一项所述的方法，其中至少一种脂质为磷脂。11.技术方案10所述的方法，其中至少一种磷脂为DPPC。12.技术方案1-11任一项所述的方法，其中至少一种脂质为甾醇。13.技术方案12所述方法，其中所述甾醇是胆固醇。14.技术方案1-13任一项所述方法，其中有机溶剂为叔丁醇。15.技术方案1-14任一项所述方法，其中混合物在不多于约2小时内从至少约55℃冷却至不高于约35℃。16.技术方案1-15任一项所述的方法，其中有机溶剂进一步包含溶解在其中的生物活性物质。17.技术方案16所述方法，其中生物活性物质为MUC-1肽，或该肽的糖基化和/或脂质化(1apidated)衍生物。18.技术方案17所述方法，其中生物活性物质有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。19.技术方案18所述方法，其中所述物质在赖氨酸位点被脂质化(1apidated)。20.技术方案17-19任意项所述方法，其中所述物质被棕榈酰化。21.技术方案17所述方法，其中生物活性物质有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。22.技术方案21所述方法，其中生物活性物质在最后两个丝氨酸上被脂质化(lapidated)。23.技术方案22所述方法，其中生物活性物质被糖基化。24.技术方案23所述方法，其中糖基化模式与BGLP40定义的一样。25.技术方案1-24任项所述的方法，进一步包括提供在所述水流，所述有机溶剂流，或由所述混合引起的混合液流中引发湍流的方法。附图说明图1为装置布局示意图，其中的嵌入物描述的烂T”型连接排布，和任选地，是否管道可包括内部突起或挡板以增强湍流度，其有助于混合。图2为流程图，描述了总体临床制备过程中的各类参数。图3为一幅照片，显示在使用不同管道直径的情况下染料(模拟脂质/溶剂)和水的聚集情况：(A)两管均为9mm直径；(B)5mm(水)管和3mm(脂质/溶剂)管。图4为透射电镜照片(放大倍数18K)，显示依照本方法采用20％叔丁醇制备的载有MUC-1肽的脂质体形成。具体实施方式本方法可适用于大规模商业化的生产纳米级别的脂质体制剂，特别是那些包括基本上匀质的不超过200nm直径的脂质体粒径。优选地，脂质体中多于90％(采用动态光散射测得的权重(weighted)体积)小于200nm，最优选的，多于99％的小于200nm。此类粒径的颗粒可直接依照工业认可的临床生产标准过滤除菌。所述粒径均匀的脂质体可依照本专利技术制备，包括控制有机溶剂的浓度，并在脂质体形成以及接下去的过程中保持其基本恒定。通过控制溶剂浓度有可能控制脂质体颗粒的粒径，所述颗粒是在脂质溶液与水(或其它适于脂质体形成的水性溶剂)汇合和相混时形成的。在本方法中，脂质溶液与水在管道连接处正下方的“中流”处发生汇合，通过所述管道安排溶液和水被初始泵入。脂质溶液持续地流过一个管道并流入持续流动的水流中。两条液流可能以任何角度交汇，故水和脂质溶液分别流经的管道可能以约90度或小于90度的角度汇合。脂质溶液与水的浑浊混合物，即“溶剂云”，在管道连接处下方形成，且这里也是开始形成脂质体的分界线。进一步地，脂质/溶剂与水性液体混本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，包含特定粒径的脂质体，其中至少约90％的所述脂质体的粒径小于约200nm且其中所述脂质体还包含MUC‑1肽，或MUC‑1肽的糖基化和/或脂质化衍生物，其中组合物由包含如下步骤的方法得到：提供基本上连续流动的水流，提供基本上连续流动的有机溶剂流，所述有机溶剂包含溶于其中的至少一种脂质和至少一种MUC‑1肽，所述脂质能形成脂质体，将所述水流和有机溶剂流基本上持续地混合，以得到混合物，提供在所述水流，所述有机溶剂流，或由所述混合引起的混合液流中引发湍流的装置，以在不多于约2小时内至少约20℃的速度冷却所述混合物，且使在所述混合物内部形成脂质体，其中，控制水流流速对有机溶剂流的流速之比以获得至少约90％的脂质体粒径小于约200nm的脂质体制剂。

【技术特征摘要】
2008.12.17 US 61/1383531.一种组合物，包含特定粒径的脂质体，其中至少约90％的所述脂质体的粒径小于约200nm且其中所述脂质体还包含MUC-1肽，或MUC-1肽的糖基化和/或脂质化衍生物，其中组合物由包含如下步骤的方法得到：提供基本上连续流动的水流，提供基本上连续流动的有机溶剂流，所述有机溶剂包含溶于其中的至少一种脂质和至少一种MUC-1肽，所述脂质能形成脂质体，将所述水流和有机溶剂流基本上持续地混合，以得到混合物，提供在所述水流，所述有机溶剂流，或由所述混合引起的混合液流中引发湍流的装置，以在不多于约2小时内至少约20℃的速度冷却所述混合物，且使在所述混合物内部形成脂质体，其中，控制水流流速对有机溶剂流的流速之比以获得至少约90％的脂质体粒径小于约200nm的脂质体制剂。2.权利要求1所述的组合物，其中脂质体包含磷脂，所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，磷脂酰胆碱(PC；卵磷脂)，磷脂酸(PA)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰丝氨酸(PS)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，二硬脂酰磷脂酸(DSPA)，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)，二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。3.权利要求1所述的组合物，其中脂质体包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPP...

【专利技术属性】
技术研发人员：RA迪皮，WJ赖利，
申请(专利权)人：肿瘤防护公司，
类型：发明
国别省市：美国;US