去除DNA解链分析中的荧光背景的量子方法技术

本申请提供一种从使用荧光染料生成的解链曲线中去除背景的方法，用于分析核酸样品的解链谱图。所述方法包括：作为温度的函数测量核酸样品的荧光以产生具有解链过渡的原始解链曲线，所述核酸样品包含核酸和结合核酸以形成通过荧光可检测的络合物的分子，所述原始解链曲线包括背景荧光信号和核酸样品信号；和通过使用量子算法从所述核酸样品信号中分离所述背景信号以生成校正的解链曲线，所述校正的解链曲线包括所述核酸样品信号。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】去除DNA解链分析中的荧光背景的量子方法
本申请要求2013年8月30日提交的题为“去除DNA解链分析中的荧光背景的量子方法”的美国临时申请第61/872,173号的优先权及权益，该临时申请以全文并入本文。专利技术背景螺旋度是对双链形式的核酸部分的量度。利用260nm测量值的增色效应的经典吸光度测量法使用了简单的基线外推和归一化来生成与螺旋度预测紧密相配的解链曲线。吸光度解链曲线是DNA螺旋度的“金标准”，但它们需要相对大量的DNA(μg级)以及0.1-1.0℃/min的解链速率。用于DNA解链的荧光方法近来变得流行，部分原因是它们可以使用显著更少量的核酸，并且可以经常在PCR混合物上实施，通常是在同一实时PCR仪器中。由荧光监控生成的解链曲线的优点还包括它们的生成速率比吸光度测量法快60倍。虽然吸光度方法被认为是金标准，但荧光解链曲线已经获得广泛使用。然而，使用荧光方法生成的解链曲线受存在的染料的影响。用于分析DNA序列变异的方法可以分成两个大体的类别：1)对已知序列变异体进行基因分型，和2)扫描未知变异体。用于对已知序列变异体进行基因分型的方法有许多，可以使用利用荧光探针的单步、均相、闭管方法(LayMJ等人，Clin.Chem1997；43:2262-7)。相比之下，大多数用于未知变异体的扫描技术都需要在PCR之后凝胶电泳或柱分离。这些包括单链构象多态性(OritaO等人，ProcNatlAcadSciUSA1989；86:2766-70)、杂双链体迁移(NatarajAJ等人，Electrophoresis1999；20:1177-85)、变性梯度凝胶电泳(AbramsES等人，Genomics1990；7:463-75)、温度梯度凝胶电泳(WartellRM等人，JChromatogrA1998；806:169-85)、酶或化学切割方法(TaylorGR等人，GenetAnal1999；14:181-6)以及DNA测序。通过测序识别新突变也需要在PCR之后的多个步骤，即循环测序和凝胶电泳。变性高性能液相色谱(XiaoW等人，HumMutat2001；17:439-74)包括将PCR产物注入柱中。大量平行测序需要多个步骤和昂贵的仪器装备，并且与在PCR之后无任何额外处理的一或二分钟的解链曲线相比运转周期很长。单核苷酸多态性(SNP)是目前在人类及其他物种中观察到的最常见的遗传变异。在这些多态性中，在个体之间仅单个碱基变化。该改变可以引起蛋白质中氨基酸变化，改变转录的速率，影响mRNA剪接，或者对细胞过程无明显作用。有时候，当变化是沉默的(例如当它编码的氨基酸不变时)，如果所述改变与另一遗传改变所引起的独特的表型有关联(有关)，则SNP基因分型可能仍是有价值的。用于SNP基因分型的方法有许多，大多数使用PCR或其他扩增技术以扩增所感兴趣关心的模板。可以使用同时发生或随后的分析技术，包括凝胶电泳、质谱和荧光。有吸引力的荧光技术是均相并且在开始扩增后不需要添加试剂或为了分析对反应物进行物理取样。示例性均相技术使用寡核苷酸引物以定位感兴趣区域和用于生成信号的荧光标记或染料。各种基于PCR方法都是完全闭管的，使用对DNA变性温度稳定的热稳定酶，以使得加热开始之后不需要添加物。数个闭管、均相、荧光PCR方法可适用于对SNP进行基因分型。这些包括使用具有两个互相作用的生色团的FRET寡核苷酸探针(相邻杂交探针、TaqManTM探针、分子信标、Scorpions)、具有仅一个荧光团的单寡核苷酸探针(G-猝灭探针，Crockett，A.O.和C.T.Wittwer，Anal.Biochem.2001；290:89-97和SimpleProbes，BioFireDiagnostics)的系统，以及使用dsDNA染料而不是共价的、荧光标记的寡核苷酸探针的技术。用dsDNA荧光染料监控DNA解链的PCR方法连同实时PCR已经普及。因为PCR产生足够用于荧光解链分析的DNA，且扩增和分析二者可以在同一试管中实施，从而提供不需要加工或分离步骤的均相、闭管系统。dsDNA染料一般用于通过它们的解链温度或Tm来识别产物。DNA解链分析的效力取决于其分辨率。用于基因扫描的高分辨率解链分析主要依靠PCR产物的解链过渡(meltingtransition)的形状。在很多情况下，解链过渡的高分辨率分析还可以无探针的基因分型。通过使用标记或未标记的探针，能够获得在较小区域针对变异体区分的实际更高的特异性。特定基因分型是通过使探针下的序列改变与探针Tm的变化相关联来推断。随着染料和仪器装备方面新近的进步，可同时在一个反应中任选地实施使用未标记探针的高分辨率基因扫描和基因分型(美国专利第7,582,429号，全文以引用方式并入本文)。可以在饱和DNA染料存在下观察到PCR产物和探针解链过渡二者。除筛选PCR产物中引物之间的任何序列变异之外，常见的多态性和突变也可以被基因分型。此外，无偏、分层聚类可以准确地将解链曲线分组成基因型(美国专利第8,296,074号，全文以引用方式并入本文)。一个、两个或甚至更多未标记探针可用在单个PCR中。在同步基因分型和扫描中，产物解链分析检测两个引物之间任何位置的序列变异，而探针解链分析识别探针下的变异。如果序列变异在引物之间并且在探针下，可获得变异的存在和其基因型二者。如果产物解链显示变异但探针没有，则变异可能发生在引物之间而不是在探针下，并且可能需要用于基因分型的进一步分析。探针可以置于共有序列变异的位点以使得在大多数情况下，如果产物扫描是阳性，则探针将识别序列变异，从而大幅降低对测序的需求。用一个探针，可以通过PCR产物和探针解链二者确立SNP的基因型。用两个探针，可以探究序列的两个单独区域的基因分型，并且针对PCR产物的其余扫描稀有序列变异。如果探针的解链温度不同并且如果各等位基因存在独特的探针和/或产物解链图谱，可以使用多个探针。同步基因分型和扫描以及使用解链分析的其他基因分型技术是有前景的研究领域。然而，在高分辨率能力前的解链曲线分析缺乏特异性和准确性。随着高分辨率解链曲线分析的出现，背景荧光噪音可妨碍使用解链曲线准确地对SNP进行基因分型、检测序列变异和检测突变。与扩增子有关，先前的背景荧光去除技术已经导致一些错误的调用(call)。例如，基线技术使用线性外推作为用于归一化解链曲线和去除背景荧光的方法。这种技术适用于标记的探针。然而，这种技术及其他先前归一化技术不如使用未标记的探针(ZhouL，MyersAN，VandersteenJG，WangL，WittwerCT.Closed-TubeGenotypingwithUnlabeledOligonucleotideProbesandaSaturatingDNADye.ClinChem.2004；50:1328-35)，多重小扩增子解链(LiewM，NelsonL，MargrafR，MitchellS，EraliM，MaoR，LyonE，WittwerCT.Genotypingofhumanplateletantigens1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分析核酸样品的解链谱图的方法，所述方法包括作为温度的函数测量所述核酸样品的荧光以产生具有解链过渡的原始解链曲线，所述核酸样品包含核酸和结合所述核酸以形成通过荧光可检测的络合物的分子，所述原始解链曲线包括背景荧光信号和核酸样品信号；和使用量子算法将所述背景信号从所述核酸样品信号中分离，以生成校正的解链曲线，所述校正的解链曲线包括所述核酸样品信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.30 US 61/872,1731.一种用于分析核酸样品的解链谱图的方法，所述方法包括
作为温度的函数测量所述核酸样品的荧光以产生具有解链过渡的原始解链曲线，所述核酸样品包含核酸和结合所述核酸以形成通过荧光可检测的络合物的分子，所述原始解链曲线包括背景荧光信号和核酸样品信号；和
使用量子算法将所述背景荧光信号从所述核酸样品信号中分离，以生成校正的解链曲线，所述校正的解链曲线包括所述核酸样品信号；
其中通过使用量子算法的所述分离包括使用以下式：
ln(I/I参考)＝C(1/T-1/T参考)，
其中：
T参考是参考温度，
I参考是荧光染料在所述参考温度下的参考荧光强度，并且
C是校准常数；并且
其中通过使用量子算法的分离包括计算和使用至少两个校准常数，其中所述分离步骤包括将来自所述原始解链曲线的初始X轴和初始Y轴重新标度：
x＝(1/T-1/T参考)(°K)和
y＝ln(I/I参考)。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤还包括在所述解链过渡之前计算第一条线H(T)，和在所述解链过渡之后计算第二条线L(T)，其中在所述解链过渡之前的校准常数是第一条线的斜率，在所述解链过渡之后的校准常数是第二条线的斜率。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述分离步骤还包括将所述解链谱图、H(T)和L(T)重新标度至所述初始X轴和所述初始Y轴。


4.根据权利要求3所述的方法，还包括使用以下式按比例计算H(T)与L(T)之间的解链曲线的步骤：
M(T)＝F(T)–L(T)/H(T)–L(T)，
其中：
M(T)＝解链曲线，
F(T)＝荧光。


5.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述分离步骤前将偏移加至所述原始解链曲线。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸样品是PCR反应的双链产物。


7.根据权利要求1所述的方法，其中对所述核酸样品针对已知的序列变异进行基因分型，并且针对未知序列变异进行扫描。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品还包括未标记探针，并且所述校正的解链曲线包括针对PCR产物和未标记探针二者的解链过渡。


9.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种序列变异可以存在于所述核酸中，根据所述校正的解链曲线或其导数鉴别所述变异。


10.根据权利要求1所述的方法，还包括对所述核酸进行基因分型。


11.根据权利要求10所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·T·威特沃，L·N·斯坦福，
申请(专利权)人：犹他大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US