本发明专利技术公开了一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，该试剂盒是一种基因在恒定温度下进行扩增和检测的试剂盒。本发明专利技术的恒温扩增反应试剂配合一种双色荧光标记的探针，可以进行快速荧光检测。本发明专利技术的恒温扩增体系，真正实现在同一个温度下进行基因扩增反应，反应体系不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。本发明专利技术的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在15min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，特别涉及一种不依赖于高能 能量分子的恒温扩增技术。
技术介绍
阴道炎是妇产科患者最常见疾病，每年约有500~1000万女性罹患此病，而75%的妇 女在一生中至少患病1次。传统的阴道炎诊断方法主要依赖于患者主诉、阴道检查以及实验 室检查。阴道炎的症状缺乏特异性，因此在缺乏实验室确诊依据时，依据患者主诉和其他检 查难以确诊。多数阴道炎患者即使反复感染，依然无法确认发病原因，且阴道炎患者多为混 合感染，因此阴道炎的确诊十分困难。阴道炎最常见类型为细菌性阴道炎、真菌性阴道炎和 滴虫性阴道炎，三者约占所有阴道炎的80%~90%。细菌性阴道炎(BV)是一种由阴道加特纳菌 和一些压氧菌的混合感染，导致阴道内微生态平衡失调，引起的阴道分泌物增多，白带有鱼 腥臭味及外阴瘙痒灼热的综合征。可分为嗜血杆菌性阴道炎、棒状杆菌阴道炎、压氧菌性阴 道病炎、加特纳菌性阴道炎等。本病也可通过性接触传染，在性关系混乱的人群中发病率较 高。念珠菌性阴道炎也称霉菌性阴道炎，是由念珠菌感染引起。其发病率仅次于细菌性阴道 病。念珠菌性阴道炎多见于幼女、孕妇、糖尿病患者，以及绝经后曾用较大剂量雌激素治疗 的患者。滴虫性阴道炎是由毛滴虫引起，寄生人体的毛滴虫有阴道毛滴虫、人毛滴虫和口腔 毛滴虫，分别寄生于泌尿生殖系统、肠道和口腔，与皮肤病有关的是阴道毛滴虫，引起滴虫 性阴道炎。长期阴道炎可能导致不孕;影响日常生活的质量;会影响到胎儿的发育，导致早产 或者流产;诱发其他疾病，如生殖器感染，盆腔炎、子宫内膜炎、夫妻生活痛等;所以及时检 测及定期检测阴道炎致病病原体具有预防和治疗的积极意义。基于病原体DNA直接进行检 测，相比涂片敏感性大大提尚，可以极大提升阳性检出率。阴道炎致病病原体DNA的检测常用到传统PCR技术，检测程序需要设置多个循环， 每个循环包括核酸的变性、退火、延伸，这导致PCR在技术应用上有几点限制:第一，PCR技 术需要昂贵的实验室仪器，同时仪器要具备精细的温度控制程序和加热模板，从而实现很 高的温度下的DNA模板链的变性，较低的温度下引物探针退火延伸模板，这样重复温度变 化几十个循环之后实现模板量的放大。由于每一个循环时间都较短，仪器必须能快速准确 升降温度，这就需要银制或金制的加热模块，增加了仪器研制的成本。第二，PCR扩增体系 中的聚合酶必须具有耐受高温的能力，否则必须在每一个循环中重新加入新酶，以实现下 一循环的扩增，这样极容易造成污染也加大了成本。第三，在PCR循环中，每一个循环引物 退火的时间都很短(几秒到十几秒)这就要求引物必须快速找到模板上同源匹配的区段，以 实现延伸。这就要求PCR体系必须有过量的PCR引物。过量的引物会与模板错配，错误引 发扩增，引物二聚体等等，进而抑制PCR扩增，特别是在模板量低的情况，会使这种情况加 剧。本专利技术恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温 条件下（如37°C)进行核酸的扩增，与传统的PCR技术相比，因此不需要昂贵的仪器，也避免 了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模 板错配或生成引物二聚体的可能性。另外，恒温扩增体系有多重工具酶匹配进行有效扩增， 扩增效率远远高于传统PCR技术，所用时间更短，最短可以在5min内实现。最后，相对于目前 其他恒温扩增技术平台相比，本专利技术所用的重组酶依赖扩增技术平台是新一代核酸检测的 利器，在检测的时效性，便捷性和技术参数等多个方面都优于其它恒温扩增技术平台，通过 试剂的有效匹配，甚至可以在人体腋下进行扩增反应。在该技术平台上，除了可以开发基于 小型便携式设备用于医疗检测机构如医院急诊科、妇产科、手术室;社区服务中心和基层医 疗机构;检验检疫疾病防控机构的分子诊断产品，还可以开发出适合家庭使用的分子诊断 产品，使我国不同区域即便存在经济条件参差不齐的情况下，也可以展开全国性病毒性疾 病、肿瘤和遗传性疾病的定期和快速普查。这是一个非常巨大的潜在市场，其经济价值和社 会效益不可估量。当前我们已经开发适用于医疗机构和家庭使用的HIV检测产品和宫颈癌 HPV检测产品。随着平台的不断成熟，可进一步拓展到食品安全、检验检疫、防恐等多个领 域。 本专利技术阴道炎病原体基因即时检测试剂盒将恒温扩增技术应用到阴道炎病原微 生物的检测上，缩短了反应时间，降低了体系对反应条件的要求，大大地提高了检测的效 率，也不需要人为主观判读结果，同时检测结果不受混合感染的干扰，因此能更准确的提示 混合感染的类型，非常有利于临床的快速诊断和对症治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，包括反应液，启 动液，反应酶系，阴道炎病原体特异性引物及探针。 阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应液的具体组分如下：作为上述反应液的进一步改进，Tris-HCl的pH为7.0~9.0，优选pH为8.3。 阴道炎病原体基因即时检测试剂盒启动液的具体组分如下：作为上述启动液的进一步改进，氯化镁的优选浓度为10mM。 阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应酶系的具体组分如下：作为上述反应酶系的进一步改进，重组酶选自E.coliRecT蛋白；λ·菌体β蛋白；啤酒 酵母SepI/STPi3;啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPa蛋白；粟酒裂殖酵母ρ14()/ΕΧ〇II蛋白以及 RrpI、HPP-I、v-SEP、ICP8蛋白。 阴道炎病原体基因即时检测试剂盒特异性引物及探针序列如下：作为本专利技术方法的进一步改进，恒温扩增的温度为35~42°C，优选扩增温度为37°C。 本专利技术的有益效果： 本专利技术的恒温扩增体系，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩 增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。本专利技术的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在15 min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。本专利技术的恒温扩增体系使用荧光实时定量技术，应用范围更广，适用于市面上大 多数荧光定量扩增仪。本专利技术同时检测3种阴道炎常见的致病病原体，其中念珠菌属检测包括6种常见致 病念珠菌种：白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠 菌。对比常规检测的培养方法，时间更短，灵敏度高受培养条件限制少，人为误操作几率低。 【附图说明】： 图1至图9依次分别为实施例1至实施例9的荧光结果图，图中荧光曲线的标号对应实施 例中反应管的标号。【具体实施方式】 -种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，采用了一种不依赖于高能能量分子的恒 温扩增技术。试剂盒成分包括反应液，启动液，反应酶系，阴道炎病原体特异性引物及探针， 各成分的具体组分如下：下面结合具体的实验，进一步说明阴道炎病原体基因即时检测试剂盒的优势，但并非 限制本专利技术。 实验样本来源： 以阴道炎患者阴道分泌物中分离的阴道滴虫、阴道加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠 菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌经提取得到的核酸溶液作为样本； 以混合感染阴道滴虫-阴道加德纳菌、阴道滴虫-白色念珠菌、阴道加德纳菌-白色念珠 菌的患者阴道分泌物提取得到的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，其反应液组成如下：Tris‑HCl 50 mMKCl 60 mM二硫苏糖醇 2 mM甜菜碱 1M海藻糖 5.5%PEG 5.5%BSA 0.1mg/mL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈华云，刘淑园，陈嘉昌，刘孝礼，丁渭，肖湘文，黄爽，曾烨，彭俊然，
申请(专利权)人：广州和实生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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